生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_トリパノソーマ症の予防・治療薬 |
| 出願番号： | 2004200142 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | A61K 31/553,A61P 33/00,A61P 43/00,C07D 498/22 |
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井上 雅広 福間 利英 JP 2007297280 公開特許公報(A) 20071115 2004200142 20040707 トリパノソーマ症の予防・治療薬 学校法人 久留米大学 599045903 吉田 芳春 100081271 井上 雅広 福間 利英 A61K 31/553 20060101AFI20071019BHJP A61P 33/00 20060101ALI20071019BHJP A61P 43/00 20060101ALI20071019BHJP C07D 498/22 20060101ALI20071019BHJP JPA61K31/553A61P33/00A61P43/00 111C07D498/22 4 ＯＬ 10 4C072 4C086 4C072AA03 4C072AA07 4C072BB04 4C072BB08 4C072CC03 4C072CC11 4C072EE09 4C072FF02 4C072GG08 4C086AA01 4C086AA02 4C086CB22 4C086MA01 4C086MA04 4C086NA14 4C086ZB38 4C086ZC20 本発明は、アフリカ睡眠病、シャーガス病等の、トリパノソーマ原虫の感染によって起こるトリパノソーマ症（trypanosomiasis）の予防、治療薬に関する。 トリパノソーマ症は、トリパノソーマという鞭毛を持った原虫の感染で起こる寄生虫病であり、一般には、アフリカトリパノソーマ症（いわゆるアフリカ睡眠病）とアメリカトリパノソーマ症（シャーガス病）とに区別される。 アフリカ睡眠病には、さらに２つの型が知られており、ガンビアトリパノソーマを原因とする西アフリカのタイプと、より進行の早いローデシアトリパノソーマを原因とする東アフリカのタイプとがある。いずれも、この地域に分布するツェツェバエによって媒介される病気であり、現在はアフリカ３６ヶ国で流行し、五千万人が感染の危険に曝されている。 一方、シャーガス病は、クルーズトリパノソーマ原虫がサシガメという吸血性のカメムシ類によって媒介されて起こる人畜共通の感染症である。この病気はラテンアメリカのみに存在し、現在１−２千万人の患者がいるとされ、公衆衛生上深刻な問題となっている。 上記のトリパノソーマ症の症状は、例えばガンビアトリパノソーマ原虫の場合、経過は比較的慢性であるが、中枢神経が侵されると予後不良である。ツェツェバエの吸血により感染し、通常５〜２０日の潜伏期を経た後、原虫が血中、次いでリンパ節に入り増殖する。ツェツェバエ刺咬部は有痛性の丘疹を生じ、その他、リンパ節腫脹、発熱、肝脾腫大などを示す。原虫が中枢神経系に侵入する時期になると、頭痛、意識混濁、嗜眠、貧血などを起こし、全身衰弱で死亡する。 診断は、血液、リンパ節穿刺液、脳脊髄液などから原虫を検出することにより行う。しかし虫体が少ない時は見出しにくく、実験動物に接種しても感染しにくい。また、免疫学的診断法としてはELISA法がよく用いられる。さらに、Winterbottom徴候（頸部の無痛性リンパ節腫脹）やKerandel徴候（尺骨を圧迫すると数分後に強い痛みを訴える）なども初期診断上の助けとなる。 このようなトリパノソーマ症の治療法としては、感染初−中期（血液、リンパ節寄生期）では、スラミン（suramin）、イセチオン酸ペンタミジン（pentamidine isethionate）等が投与され、また、感染中−末期（中枢神経期）では、血液脳関門を通過する薬剤、例えば、メラルソプロール（melarsoprol, Mel B）、メラルソニルカリウム（melarsonyl potassium, Mel W）、ニトロフラゾン（nitrofurazone, Furacin）、トリパサマイド（商品名）等が用いられている。 また、従来の特許としては、（特許文献１）に、３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）プロピルホスホン酸からなるトリパノソーマ症の予防・治療剤が開示されている。さらに、（特許文献２）には、２−ニトロイミダゾール−１−イル−Ｎ−プロパルギルアセトアミドを有効成分とする抗トリパノソーマ原虫剤が開示されている。 これらの治療薬は、一定の予防・治療効果が得られるものであるが、より安全かつ有効な新薬の開発が望まれていた。特開２００１−１９６４１号公報特開平６−３４５７３９号公報 そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、アフリカ睡眠病等のトリパノソーマ症に対して安全かつ有効に作用する新規な予防・治療薬を提供することを目的とする。 上記課題を解決するため、本発明は、インドロカルバゾール骨格を有し、プロテインキナーゼＣを阻害する下記（化３）の化学構造、及びその薬理上許容される塩からなることを特徴とするトリパノソーマ症の予防又は治療薬を提供する。 ただし、化３中、〔Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝Ｈ〕、〔Ｘ１＝ＯＨ、Ｘ２＝Ｘ３＝Ｈ〕、〔Ｘ１＝Ｘ３＝Ｈ、Ｘ２＝ＯＨ〕、又は〔Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ、Ｘ３＝ＣＯ-Ｐｈ〕である。 上記構成によれば、トリパノソーマ原虫の細胞内で、主にタンパク質のリン酸化が阻害される（ＰＫＣ阻害作用）。その結果、トリパノソーマ原虫の生育が抑制され、あるいは細胞死が誘導される。 また、本発明は、インドロカルバゾール骨格を有し、プロテインキナーゼＣを阻害する下記（化４）の化学構造、及びその薬理上許容される塩からなることを特徴とするトリパノソーマ症に用いられる予防又は治療薬を提供する。 上記構成によれば、上記請求項１の化合物の中でも、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に対する選択性が高く、トリパノソーマ原虫の生育阻害作用の大きい化合物が選択される。なお、上記（化４）に示す化合物は、カルフォスチンＣ（Calphostin C、UCN-01）と呼ばれ、膵癌、大腸癌、腎臓癌等に有効な抗癌剤として知られている（特開昭６２−２２０１９６号）。 さらに、本発明は、本発明のトリパノソーマ症予防又は治療薬が、ヒト肺癌株Ａ５４９に対する殺細胞効果が認められないＩＣ５０値以下の濃度で使用されることを特徴とする。 本発明のトリパノソーマ症予防又は治療薬は、単独では殺癌効果が認められない低濃度で、有効な抗トリパノソーマ作用が発揮される。したがって、人体に対する安全性が高い薬剤となる。 さらに、本発明のトリパノソーマ症予防又は治療薬は、対象とするトリパノソーマ症が、アフリカ睡眠病（African sleeping sickness、African trypanosomiasis）であることが好ましい。 上記構成によれば、本治療薬が特に対象とするトリパノソーマ症が特定される。 本発明によれば、アフリカ睡眠病等のトリパノソーマ症に対して有効かつ安全な予防・治療薬が提供される。 特に、上記（化４）に係る化合物（カルフォスチンＣ）は抗トリパノソーマ作用に優れ、また、ヒト癌細胞に対して効果がないような低濃度であっても十分な治療効果を得ることができるため、安全性が非常に高い薬剤となる。 以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。 本発明のトリパノソーマ症予防・治療薬は、インドロカルバゾール骨格を有し、プロテインキナーゼＣを阻害する上記（化３）の構造を有するものである。ここで、（化３）中、〔Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝Ｈ〕、〔Ｘ１＝ＯＨ、Ｘ２＝Ｘ３＝Ｈ〕、〔Ｘ１＝Ｘ３＝Ｈ、Ｘ２＝ＯＨ〕、又は〔Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ、Ｘ３＝ＣＯ-Ｐｈ〕である。すなわち、本発明に包含される化合物は、次の（化５）〜（化８）で表される。 上記（化５）に示す化合物は、スタウロスポリン（Staurosporine）と呼ばれ、強い細胞障害作用を有している。また、（化６）〜（化８）はスタウロスポリンの誘導体であり、それぞれＵＣＮ−０１（Calphostin C）、ＵＣＮ−０２、ＣＧＰ４１２５１と呼ばれている。いずれも細胞内の情報伝達の重要な因子であるタンパク質リン酸化酵素（プロテインキナーゼＣ、ＰＫＣ）の阻害作用を有し、トリパノソーマ原虫の生育を効果的に抑制することができる。 特に、上記（化６）に示す化合物は、インドロ[2,3-a]カルバゾール骨格を有するスタウロスポリンの７位に水酸基が結合した構造を有し、プロテインキナーゼＣに対して高い選択性を持つ（ＩＣ５０＝５０ｎＭ）。すなわち、細胞周期のＧ１期からＳ期への進行を制御するタンパク質リン酸化酵素であるCyclin依存性キナーゼに直接的、あるいは間接的に作用して、Ｒｂタンパク質のリン酸化を細胞内で阻害し、細胞周期のＧ１期集積作用を示す。本発明者は、この（化６）に係るカルフォスチンＣをトリパノソーマ原虫に作用させることにより、極めて有効な治療効果が得られることを見出した。 また、上記カルフォスチンＣは、各種動物実験では膵癌、大腸癌、腎臓癌などに有効性を示す抗癌剤として知られているが、本発明が対象とするトリパノソーマ症に対しては、単独では殺癌効果が得られないような低濃度で使用しても十分な抗トリパノソーマ作用が得られることが判明した。例えば、ヒト肺癌株Ａ５４９に対して殺細胞効果が認められないＩＣ５０値以下、具体的には４０ｎＭ付近の濃度で用いても有効な治療効果を得ることができる。したがって、人体に対して非常に高い安全性を確保することができる。 なお、低濃度で作用する理由は定かではないが、後述の比較例で述べる通り、他のＰＫＣ阻害剤では抗トリパノソーマ作用が得られないことから、ＰＫＣ阻害作用以外の、例えば脂質性シグナル分子を産生する細胞内シグナル伝達酵素の一つであるフォスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の阻害などが関わっていると考えられる。 上記（化５）〜（化８）に係る化合物を製造するに際しては、従来知られた方法を用いて適宜行うことができる。 例えば、ストレプトマイセス属に属する微生物を用いて発酵により上記（化６）及び（化７）のＵＣＮ−０１、ＵＣＮ−０２を製造する方法（特開昭６２−２２０１９６号）、スタウロスポリンに対しアミノ基の保護基としてベンジルオキシカルボニルクロライドを反応させ、得られた化合物を酢酸中、四酢酸鉛を用いて酸化し、ついで接触還元により脱保護を行いＵＣＮ−０１を得る方法（ＷＯ／０７１０５）、スタウロスポリンをジメチルスルホキシド及びアルカリ水溶液からなる溶液中で酸化してＵＣＮ−０１とＵＣＮ−０２とのラセミ混合液を製造し、シリカゲル等の担体を用いたカラムクロマトグラフィーによりＵＣＮ−０１を得る方法（特開平６−９６４５）等を挙げることができる。また、上記のラセミ混合液を酸性にすることによりＵＣＮ−０２を異性化させてＵＣＮ−０１を製造することもできる（特開２０００−１８６０９２号）。さらに（化８）に示す化合物は、スタウロスポリンに無水安息香酸を反応させる方法等により得ることができる。 上記の方法により得られた生成物は、例えば抽出、結晶化、各種クロマトグラフィー等の適宜手段により単離、精製を行うことができる。 また、上記（化５）〜（化８）に係る化合物は、薬理的に許容される塩として用いても良い。例えば、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、シクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、アミノ酸塩等を挙げることができるがこれに限定されるものではない。 以上のトリパノソーマ症治療薬は、医薬上許容される種々の賦形剤又は担体と混合し、注射剤、カプセル剤、錠剤、懸濁剤、坐剤等の種々の剤型にして使用することができる。通常は、生理食塩水、ブドウ糖、ラクトース、マンニトール等の担体に混合、分散、乳化させて注射液とし、静脈内投与することが好ましい。さらに、抗生物質等の他の薬剤との合剤として使用しても良い。 静脈内投与する場合、その投与量は年令、性別、体重、症状等によって適宜設定することができる。また、本発明は、主にトリパノソーマ症の発病後に投与されるが、予防薬として用いることもできる。 以下、実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明する。（実施例１） まず、上記（化６）で表されるカルフォスチンＣを段階的に希釈した１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌのトリパノソーマ・ブルーセイ原虫培養液を調製した。この培養液を、トリプリケートで一昼夜培養を行った。その後、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（プロメガ社）を用いて、細胞の中のＡＴＰ含量、つまり生細胞数を測定した。その結果を図１に示す。 図１において、横軸はカルフォスチンＣの濃度、縦軸はルシフェラーゼの活性すなわちＡＴＰ含量を示している。図１から明らかなように、４０ｎＭ付近の低濃度から抗トリパノソーマ作用を示すことが明らかとなった。 なお、４０ｎＭ付近の濃度では、カルフォスチンＣはヒト癌細胞（ヒト肺癌株Ａ５４９）に対する殺細胞効果が認められないことが知られている。（実施例２） 次に、実際の感染型であるローデシアトリパノソーマIL1501株で、上記実施例１と同様の実験を行い、Relative Luciferase activityを同様にトリプリケートで測定した。測定に用いたキットは、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏであるが、測定した機械がフルオロスキャンアセントＦＬ（サーモエレクトロン社製）であるためRelative Luciferase activityの値は前回のトリパノソーマTbb221株を用いたものと異なっている。測定結果を図２に示す。 ここでは、実験系株であるTbb221とは異なる実際にトリパノソーマ症を引き起こすローデシアトリパノソーマIL1501株を使っているために、カルフォスチンＣ感受性も若干異なるが、図２に示すように、カルフォスチンＣは極めて低濃度で有効であることが分かった。ちなみに生体のマクロファージは５００ｎＭのカルフォスチンＣでも影響がない。（比較例１） カルフォスチンＣのトリパノソーマ抑制効果が、トリパノソーマのＰＫＣ様酵素の阻害によるものかどうかを他のＰＫＣ阻害剤であるGF109203X、Myristoylated PK1で調べた。実験は上記実施例２と同様に行った。測定結果を図３及び図４に示す。 図に示すように、ＰＫＣ阻害剤GF109203X、Myristoylated PK1では、２μＭの高濃度でも抗トリパノソーマ作用を示さなかったことから、カルフォスチンＣの作用機序は他のＰＫＣ阻害剤のそれとは異なることが明らかとなった。実施例１における測定結果を示すグラフである。実施例２における測定結果を示すグラフである。比較例１における測定結果を示すグラフである。比較例１における測定結果を示すグラフである。 トリパノソーマ症に用いられる予防・治療薬であって、インドロカルバゾール骨格を有し、プロテインキナーゼＣを阻害する下記（化１）の構造、及びその薬理上許容される塩からなるトリパノソーマ症の予防・治療薬。（ただし、化１中、〔Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝Ｈ〕、〔Ｘ１＝ＯＨ、Ｘ２＝Ｘ３＝Ｈ〕、〔Ｘ１＝Ｘ３＝Ｈ、Ｘ２＝ＯＨ〕、又は〔Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ、Ｘ３＝ＣＯ-Ｐｈ〕である。 トリパノソーマ症に用いられる予防・治療薬であって、インドロカルバゾール骨格を有し、プロテインキナーゼＣを阻害する下記（化２）の構造、及びその薬理上許容される塩からなるトリパノソーマ症の予防・治療薬。 請求項２記載のトリパノソーマ症の予防・治療薬が、ヒト肺癌株Ａ５４９に対する殺細胞効果が認められないＩＣ５０値以下の濃度で使用されることを特徴とするトリパノソーマ症の予防・治療薬。 請求項１〜３のいずれか記載の予防・治療薬において、対象とするトリパノソーマ症が、アフリカ睡眠病（African sleeping sickness、African trypanosomiasis）であることを特徴とするトリパノソーマ症の予防・治療薬。 【課題】 アフリカ睡眠病（African sleeping sickness、African trypanosomiasis）等のトリパノソーマ症に対して、安全かつ有効に作用する新規な予防・治療薬を提供すること。【解決手段】 トリパノソーマ症に用いられる予防・治療薬であって、インドロカルバゾール骨格を有し、プロテインキナーゼＣを阻害するカルフォスチンＣ（ＵＣＮ−０１）、及びその薬理上許容される塩からなるトリパノソーマ症の予防・治療薬である。 この予防・治療薬は、ヒト肺癌株Ａ５４９に対する殺細胞効果が認められないＩＣ５０値以下の低濃度で使用しても、十分な抗トリパノソーマ作用を得ることができる。【選択図】 なし