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タイトル:公表特許公報(A)_皮膚皺改善用キサントリゾールの使用
出願番号:2010513123
年次:2010
IPC分類:A61K 8/34,A61Q 19/08


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ファン,ジャクワン シム・ジェ−ソク リ・ヘ−ジ チョ・ユ−ミ グォン・ソン−フイ JP 2010530412 公表特許公報(A) 20100909 2010513123 20080620 皮膚皺改善用キサントリゾールの使用 バイオケア カンパニ−リミテッド 503344078 ファン,ジャクワン 501236320 大家 邦久 100081086 林 篤史 100121050 ファン,ジャクワン シム・ジェ−ソク リ・ヘ−ジ チョ・ユ−ミ グォン・ソン−フイ KR 10-2007-0060177 20070620 A61K 8/34 20060101AFI20100813BHJP A61Q 19/08 20060101ALI20100813BHJP JPA61K8/34A61Q19/08 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW KR2008003522 20080620 WO2008156330 20081224 19 20100205 4C083 4C083AA111 4C083AA112 4C083AB282 4C083AC012 4C083AC072 4C083AC102 4C083AC122 4C083AC422 4C083AC471 4C083AC472 4C083AC762 4C083CC02 4C083CC03 4C083CC04 4C083CC05 4C083DD23 4C083DD27 4C083DD31 4C083EE07 4C083EE12 4C083EE13 本発明は、クルクマ・キサントリーザ(Curcuma xanthorrhiza)の抽出物及びキサントリゾール(xanthorrhizol)の新たな使用に関する。さらに詳しく言えば、クルクマ・キサントリーザの抽出物または下記化学式1で示されるキサントリゾールを有効成分として含む皮膚皺改善用組成物、前記抽出物または化合物の皮膚皺改善、コラーゲン合成誘導またはコラーゲン分解抑制の使用、及び前記抽出物または化合物のコラーゲン合成を誘導するか、コラーゲン分解を抑制する皮膚皺改善方法に関する。 通常、皺は、長期にわたって繰返される筋肉運動により形成される、皮膚の自然な老化現象の一つである。皮膚老化は、内因性老化と外因的老化とに大別され、内因性老化は遺伝的要因によるものであることから調節が難しいものの、外因的老化は環境的要因によるものであるため、人為的な調節が容易である。従って、外因的老化を防止するための研究が行われ、特に長期間の紫外線露出により進行する外因性光老化に伴う皺形成を防止するための研究が注目されている(Gilchre st B. A., J. Am. Acad. Dermatol., 1989: 21: 610-613:非特許文献1)。 外因性皮膚老化である光老化の臨床的特徴としては、肌が荒く弾力性がなくなり、不規則的な色素沈着が発生し、深い皺の増加がみられる。特に、美容の対象として重要な顔面、頭部等の皺形成には光老化の影響が大きいことが見い出され、抗皺化粧品開発の基礎研究として、ヒトの皮膚や動物モデルを利用した光老化と皺形成に関する研究が活発に行われている。光老化と皺形成に関しては、今まで皮膚の主要成分であるコラーゲン(collagen)の合成及び分解等の基礎的な生理代謝変化を検討した結果が多数報告されている(Lavker R. M., Blackwell science Inc., 1995: 123-135:非特許文献2)。 皮膚老化に影響を及ぼす外部因子としては、風、温度、湿度、煙草の煙、公害、紫外線等が挙げられるが、この中でも特に、紫外線による老化を光老化と言う。多量の紫外線に曝されると、皮膚に高濃度の活性酸素種(reactive oxygen species)が生成し、皮膚の酵素的及び非酵素的抗酸化防御系を崩壊させる。これにより皮膚組織の主な蛋白質であるコラーゲンが著しく減少する。このコラーゲン減少に重要な影響を及ぼすのがマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1,matrix metalloproteinase-1)である。マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)は細胞外基質(extracellular matrix)と基底膜(basement membrane)の分解に関与する酵素であり、紫外線照射により、皮膚内のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1活性が増大し、コラーゲンを著しく崩壊させることにより、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1が真皮層のコラーゲン分解に影響を及ぼして、皺形成に極めて重要な役割をしているとの研究結果等が報告されている(Sim G. S., Kim J. H et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 2005: 20(1): 40-45:非特許文献3)。 現在開発されている皮膚皺改善有効成分の一部には、極めて不安定で、皮膚への伝達が容易でないため、特別な安定化システムと伝達体系が必要な化粧品原料としての使用が不可能であるという問題や、皮膚皺の改善効果が明らかでない等の問題がある。従って、近年はレチノイド(retinoid)を含有した皮膚保護剤へと関心が漸次集中されつつある。現在、レチノイドは日光によってできた皺、皮膚の肥厚、垂れ、弾力性減少等の光老化現象を解決する手段として利用されている。しかしながら、レチノイドは極めて不安定な化合物であり、紫外線、水分、熱、酸素に敏感なため、容易に化学変化を起こす問題点を有していることから、これを解決するための天然物由来の有効成分開発に研究が集中している。 ここで、本発明者らは皺改善に効果的に使用できる天然物由来の化合物を長期間探索した結果、クルクマ・キサントリーザ抽出物から単離及び精製したキサントリゾールが、皺改善に卓越した効果を有することを見い出し、本発明を完成させた。Gilchre st B. A., J. Am. Acad. Dermatol., 1989: 21: 610-613Lavker R. M., Blackwell science Inc., 1995: 123-135Sim G. S., Kim J. H et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 2005: 20(1): 40-45 従って、本発明の課題は、キサントリゾールまたはクルクマ・キサントリーザの抽出物の新規使用を提供することにある。 前記の課題を解決するために、本発明は化学式1で示されるキサントリゾールを有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物を提供する。 さらに、本発明は化学式1で示されるキサントリゾールの皮膚皺改善用製剤、コラーゲン合成誘導剤、またはコラーゲン合成抑制剤の製造のための使用を提供する。 さらに、本発明は化学式1で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法、コラーゲン合成誘導方法、またはコラーゲン合成抑制方法を提供する。 さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物を有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物を提供する。 さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物の皮膚皺改善用製剤、コラーゲン合成誘導剤、またはコラーゲン合成抑制剤の製造のための使用を提供する。 さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法、コラーゲン合成誘導方法、またはコラーゲン合成抑制方法を提供する。 前述の通り、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、皺形成と関連した重要要素であるコラーゲン分解酵素−1(MMP−1,matrix metalloproteinase-1)の発現を抑制することにより、コラーゲンの分解を抑制し、新生コラーゲン(タイプ−1・プロコラーゲン;type-1 procollagen)の生成を促進させ、光老化による皺を改善する効果がある。従って、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物とキサントリゾールは光老化による皺改善の治療または予防に極めて有用に使用できる。本発明のクルクマ・キサントリーザ(Curcuma xanthorrhiza)抽出物によるコラーゲン分解酵素−1抑制活性を示したグラフである。本発明のクルクマ・キサントリーザ(Curcuma xanthorrhiza)抽出物によるコラーゲン合成能を示したグラフである。本発明のキサントリゾール(xanthorrhizol)によるコラーゲン分解酵素−1抑制活性を示したグラフである。本発明のキサントリゾール(xanthorrhizol)によるコラーゲン合成能を示したグラフである。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明はクルクマ・キサントリーザ(Curcuma xanthorrhiza)から単離及び精製されたキサントリゾール(xanthorrhizol)の新規な使用を提供する。 クルクマ・キサントリーザは、インドネシアの伝統的薬用植物であるショウガ科(Zingiberaceae)植物であり、一般的に、トゥムラワック(temulawak)またはジャワニーズ・ターメリック(Javanese turmeric)として知られている。クルクマ・キサントリーザは、主成分としては、アチュメノン(artumenone)、α−クルクメン(α-curcumene)、β−クルクメン(β-curcumene)、クルゼレノン(curzerenone)、ゲルマクロン(germacrone)、β−セスキフェランドレン(β-sesquiphellandrene)、α−ターメロン(α-turmerone)、β−ターメロン(β-turmerone)、キサントリゾール(xanthorrhizol)等のテルペノイド(terpenoid)系化合物、と7〜30%のエセンシャルオイル(essential oil)、30〜40%のカーボハイドレイト(carbohydrate)、及び0.02〜20%の芳香性色素であるクルクミノイド(curcuminoid)等を含む(Lin S. C. et al., Am. J. Chin. Med., 1995: 23: 243-254)。 キサントリゾールは、クルクマ・キサントリーザの代表的な構成成分であるセスキテルペン(sesquiterpene)の一種である。キサントリゾールは、口腔微生物に対する抗菌作用(Hwang, J. K. et al., Fitoterapia. 2000: 71: 321-323; Hwang, J. K. et al., Planta Medica, 2000: 66: 196-197)、抗癌剤で誘発される毒性の抑制活性(Kim, S. H. et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 2004: 196: 346-355; Kim S. H. et al., Food and Chemical Toxicology, 2005: 43: 117-122)、癌転移抑制作用(Choi, M. A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005: 326: 210-217)等を有することが知られている。しかしながら、本発明のキサントリゾールによる皺改善効果に対しては、今まで全く報告された例がない。 クルクマ・キサントリーザの抽出方法には、大韓民国出願公開第2000−0000342号明細書及び国際公開第88/05304号パンフレットに開示された通り、有機溶媒抽出法、超臨界流体抽出法、マイクロウェーブ抽出法、及び超音波抽出法等が使用できる。クルクマ・キサントリーザ抽出物からキサントリゾールを単離及び精製する過程は、大韓民国出願公開第2000−0073295号明細書に開示された例がある。 好ましくは、本発明のキサントリゾールは当業界において公知の方法、例えば、溶媒抽出法及びクロマトグラフィーを利用した分離方法により単離、精製し得る。 クルクマ・キサントリーザは、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールのような炭素数1〜6のアルコール(organic alcohol)、アセトン、エーテル、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロライド、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル(petroleum ether)、ジエチルエーテル、及びベンゼンからなる群から選ばれるいずれか1つ、またはこれらの混合溶媒を利用して抽出し得る。好ましくは、水または炭素数1〜6のアルコールを使用して抽出し得る。 抽出時のクルクマ・キサントリーザと溶媒の比率は特に限定はされないものの、クルクマ・キサントリーザ粉末に対して1〜2倍重量の溶媒を添加することができる。好ましくは、抽出効率を上げるために、クルクマ・キサントリーザ粉末に対して2〜5倍重量の溶媒を添加することができる。 抽出は、常圧、室温で行うのが好ましく、抽出時間は、抽出温度によって異なるものの、6〜96時間、好ましくは、36〜72時間かけて抽出する。さらに、抽出時に撹拌器(shaker)で撹拌すると、さらに、抽出効率を上げられる。 抽出に使用するクルクマ・キサントリーザは、収穫した後、洗浄してそのまま使用するか、または乾燥して使用してよい。乾燥方法は、天日干し、陰干し、熱風乾燥及び自然乾燥のいずれの方法で行ってもよい。さらに、抽出効率を上げるために、クルクマ・キサントリーザまたはその乾燥物を粉砕機で粉砕して使用してもよい。 抽出物からキサントリゾールを単離する方法としては、当業界において公知のクロマトグラフィーにより行われる。例えば、薄層クロマトグラフィー(TLC;thin-layer chromatography)に溶媒を展開させその展開距離に伴う分画物を得る方法であり、特に、キサントリゾールは、ヘキサンとエチルアセテートを10:1で混合した溶媒を用いたTLC法で行い、分離された特定分画物をアセチル化(acetylation)及び脱アセチル化(deacetylation)を介して分離することができる。 好ましくは、本発明のキサントリゾールは、乾燥したクルクマ・キサントリーザを20〜40メッシュ(mesh)の大きさに粉砕し、粉砕したクルクマ・キサントリーザ試料100gを75体積%のメタノール400mlと混合して、常温で2日間繰返し抽出する。抽出された試料はワットマンろ過紙第2番(Whatman filter paper No. 2)を利用してろ過することにより、粗抽出物が得られる。このようにして得られた75%メタノール粗抽出物を、エチルアセテート、ブタノールとそれぞれ1:1の比率で混合して各溶媒に対する溶解性成分を抽出し、最後に水溶性成分が得られる。各溶媒につき2回繰返し抽出した後、各溶媒層毎に分離し、溶媒成分を蒸発させ、メタノール分画、エチルアセテート分画、ブタノール分画、水分画を調製する。そのうち、エチルアセテート分画を、TLC法により、ヘキサンとエチルアセテートを10:1(v/v)で混合した溶媒で展開させ、該分画をアセチル化(acetylation)及び脱アセチル化(deacetylation)を介してキサントリゾールを得る。 前述の本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物及びキサントリゾールは、紫外線照射によって起こる、人体皮膚繊維芽細胞(human skin fibroblast)におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1,matrix metalloproteinase-1)の生成を濃度依存的に抑制し、タイプ−1・プロコラーゲン(type-1 procollagen)の合成を増加させる。さらに、紫外線を照射したヌードマウス(hairless mouse)に、クルクマ・キサントリーザ抽出物及びキサントリゾールの処理を施すと、マウスにおいてもコラーゲンの合成を増加させた。 このように、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物及びキサントリゾールは、紫外線照射によるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1の生成を抑制する効果とコラーゲンを合成する効果が極めて優れている。 従って、本発明は、クルクマ・キサントリーザ抽出物、またはキサントリゾールを有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物を提供する。前記組成物を化粧料組成物または食品組成物としてもよい。 前記化粧料組成物は、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールと共に、化粧料組成物の分野で一般的に使用される1つ以上の賦形剤及び添加剤を含み、公知の方法により、容易に製造される。 より具体的に、本発明の化粧料組成物は、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを有効成分として含有し、皮膚学的に許容可能な賦形剤と共に、基礎化粧品(化粧水、クリーム、エッセンス、クレンジングフォーム及びクレンジングウォーターのような洗顔剤、パック、ボディオイル、マッサージクリーム)、色調化粧品(coloring cosmetics)(ファウンデーション、リップスティック、マスカラ、化粧下地(make-up base))、頭髪製品(シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアゲル)の形態で製造される。前記賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、着臭剤、乳化剤、増粘剤及び溶媒を含む。さらに、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤及び保湿剤等を含み、物性改善を目的に増粘剤、無機塩類、合成高分子物質等を含む。 例えば、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを含む洗剤及び石鹸を製造する場合には、通常の洗剤及び石鹸ベースにクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを添加して容易に製造される。クリームを製造する場合には、一般的な水中油型(O/W)のクリームベースに、クルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを添加して製造される。ここに、香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤等と物性改善を目的とした蛋白質、塩、または合成高分子物質を追加して添加し得る。本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、化粧料組成物の形態にもよるが、化粧料(formulation)総重量に対して、0.005〜10重量%、好ましくは、0.01〜5重量%含有させることができる。0.005重量%より少なければ、皺改善効果を得難く、10重量%より多く配合すると、使用量に対して皺改善効果の増加は微々たるもので非経済的である。 さらには、本発明に伴うクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、食品組成物の形態で提供できる。本発明の食品組成物は、機能性食品(functional food)、栄養補助剤(nutritional supplement)、健康食品(health food)及び食品添加剤(food additives)等の全ての形態を含む。前記食品組成物は、当業界において公知の一般的な方法により多様な形態に製造し得る。 例えば、健康食品としては、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを茶、ジュース及びその他ドリンク等の飲料の形態で製造するか、または顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取できる形態で製造できる。さらに、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、皮膚皺の改善及び予防効果がある公知の活性成分と共に混合して組成物の形態で製造できる。 さらに、機能性食品、飲料(アルコール性飲料を含む)としては、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、果実及びその加工食品(例えば、缶詰果物、瓶詰果物、ジャム、マーマレード等)、魚類、肉類及びそれらの加工食品(例えば、ハム、ソーセージ、コーンビーフ等)、パン類及び麺類(例えば、うどん、そば、ラーメン、スパゲッティー、マカロニ等)、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品(例えば、バター、チーズ等)、食用植物油、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料(例えば、味噌、醤油、ソース等)等に添加して製造できる。 さらに、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを食品添加剤の形態で使用するには、粉末または濃縮液形態で製造できる。 本発明の食品組成物には、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、食品総重量に対して約0.0001〜50重量%含むのが好ましい。 さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールの皮膚皺改善用製剤の製造のための使用を提供する。同時に、クルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールのコラーゲン合成誘導剤の製造のための使用、及びクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールのコラーゲン分解抑制剤の製造のための使用を提供する。 さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法を提供する。同時に、クルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン合成を誘導する方法及びクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン分解を抑制する方法を提供する。 クルクマ・キサントリーザ抽出物、キサントリゾール及びこれらの効果は前述の通りであり、前記“有効量”とは、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールが投与対象である個体内で皮膚皺改善、コラーゲン合成誘導またはコラーゲン分解抑制の効果を示す量を意味し、前記“個体(subject)”とは、哺乳動物、特にヒト(human)を含む動物を意味する。前記個体は治療を必要とする患者(patient)でもあり得る。 本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、前述の効果のうち望む効果が得られるまで投与することができ、当業界において公知の方法により経口または非経口の多様な経路で投与できる。 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 ただし、下記実施例は本発明を例示するものであって、本発明の内容は下記実施例に限定されるものではない。実施例1:細胞増殖効果 皮膚の皺改善効果を示す細胞増殖効果を試験するために、繊維芽細胞を使用してMTT試験法[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド還元方法;3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide reduction method]を行った。 まず、ヒトの正常繊維芽細胞を96−ウェルプレート(96-well plate)の各ウェルに2×105cells/wellになるように分株して、10%牛胎児血清(FBS;fetal bovine serum)を含有したディエムイエム(DMEM)培地で37℃、5%CO2条件下で24時間かけて1次培養した。前記1次培養後、本発明の試料を各種濃度に処理し、培地を無血清培地(serum-free medium)に替えて48時間、2次培養した。前記2次培養後、MTT溶液100μlずつ培地に添加した後、4時間放置し、培地を除去した。各ウェルにジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)溶液100μlずつを添加して、20分間撹拌した後、マイクロプレートリーダー(microplate reader)により、540nmの吸光度を測定した。試験例1:クルクマ・キサントリーザ抽出物とキサントリゾールの細胞増殖効果 前記実施例1の方法により、クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物とキサントリゾールの細胞増殖効果を測定した。前記MTT試験での対照群は、試料を処理していない培地を使用し吸光度を測定し、比較群は、試料として皮膚皺改善効果があるものとして知られる緑茶抽出物(green tea extract)及びエピガロカテキンガレート(EGCG;epigallocatechin-3-gallate)を使用した。結果を下記表1に示す。 表1に示した通り、本発明のクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物及びキサントリゾールは、比較群より細胞増殖効果が優れていることが確認できた。実施例2:紫外線照射に伴う繊維芽細胞におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)及びコラーゲン生合成の測定 繊維芽細胞を2×105cells/mlの濃度で60mmディッシュ(dish)に、約85%コンフルエンス(confluence)に達するまで培養する。紫外線(UV)照射前に、培地を除去した後、細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄して、培地の血清成分を除去した後、20mJ/cm2の照射量で紫外線を照射した。繊維芽細胞に紫外線を照射した後、各試料を処理して48時間培養し、その培地を使用してマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)及びコラーゲンの発現程度を測定した。 マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)のコラーゲン生合成発現量を測定するために、ウェスタンブロット(western blot)法を利用し、繊維芽細胞が培養された培地内の総蛋白質量は、ブラッドフォード(Bradford)法により定量した。 抽出した蛋白質は、10%SDS−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動させ、ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)に移し取った。ニトロセルロース膜が、他の未知の蛋白質により汚染されないように、5%脱脂粉乳(skim milk)を使用して1時間常温で遮断(block)した。マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1及びタイプ−1・プロコラーゲン(type-1 procollagen)の1次抗体をブロッキング溶液(blocking solution)に1:1000の比率で希釈して、2時間常温で膜と反応させた。1次抗体反応後膜を10分間ずつ3回、トリス緩衝食塩水(TBST;Tris-buffer Saline Tween 20)で振りながら洗浄した。マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMP−1)とコラーゲンの1次抗体を認知する2次抗体を5%脱脂粉乳に1:1000になるように希釈して1時間常温で膜と反応させ、1次抗体の時と同様に10分間ずつ3回、トリス緩衝食塩水(TBST;Tris-buffer Saline Tween 20)で振りながら洗浄した後、化学発光法(chemiluminescence)で分析した。試験例2:クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物処理時の細胞内におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMT−1)及びコラーゲン発現量の測定 クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMT−1)抑制活性とコラーゲン合成効果を測定するために、前記実施例2のウェスタンブロット法を使用した。その結果、細胞にクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を処理した場合、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1が濃度依存的に抑制され、コラーゲン合成もやはり濃度依存的に増加することを確認した。この分析結果を図1及び図2に示す。図1に示す通り、細胞にクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を0.01μg/mlの濃度で処理したとき16%、0.1μg/mlのとき28%、0.5μg/mlのとき78%のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1抑制効果を示し、さらに、図2に示す通り、細胞にクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を0.01μg/mlの濃度で処理したとき24%、0.01μg/mlのとき127%、0.5μg/mlのとき196%のコラーゲン合成促進効果を示した。試験例3:クルクマ・キサントリーザヘキサン抽出物処理時の細胞内におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMT−1)及びコラーゲン発現量の測定 クルクマ・キサントリーザヘキサン抽出物のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMT−1)抑制活性とコラーゲン合成効果を測定するために、前記実施例2のウェスタンブロット法を使用した。その結果、試験例2でクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を処理した時と類似した活性を示し、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1は、細胞にクルクマ・キサントリーザヘキサン抽出物を0.5μg/mlの濃度で処理した場合75%抑制され、コラーゲン合成活性は同一濃度で191%増加する結果を示した。試験例4:キサントリゾール処理時の細胞内におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMT−1)及びコラーゲン発現量の測定 キサントリゾールのマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1抑制活性と、コラーゲン活性効果を測定するために、前記実施例2のウェスタンブロット法を使用したその結果、キサントリゾールを細胞に処理した場合、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1(MMT−1)が濃度依存的に抑制され、コラーゲン合成もやはり濃度依存的に増加することを確認した。この結果を図3及び図4に示す。図3に示す通り、細胞にキサントリゾールを、0.001μMの濃度で処理したとき18%、0.01μMのとき68%、0.1μMのとき92%のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1抑制活性を示し、この時、同一濃度の0.1μMで比較した時、比較群のEGCGは72%のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−1抑制活性を示し、キサントリゾール処理による活性が高いことを確認した。さらに、図4に示す通り、細胞にキサントリゾールを0.01μMの濃度で処理したとき57%、0.1μMにおいて86%のコラーゲン合成促進効果を示し、この時、同一濃度の0.1μMで比較した時、比較群のEGCGは65%のコラーゲン合成促進活性を示して、キサントリゾール処理による活性が高いことを確認した。従って、本発明のキサントリゾールは皺改善に効果があるものとして広く知られたEGCGより活性が高いものとして最終的に確認した。実施例3〜6:クルクマ・キサントリーザ抽出物を含有する化粧水の製造 クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を使用して、実施例3〜6の組成を有する化粧水を製造した。抽出物を10.0重量%、1.0重量%、0.1重量%、0.01重量%の4種の濃度にして、それぞれエタノールに溶解させ、エタノールで重量を調整して均一に混合した。実施例7〜10:クルクマ・キサントリーザ抽出物を含有するクリームの製造 クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を使用して、実施例7〜10の組成を有するクリームを製造した。まず、表3に示す物質(1)〜(5)を75〜80℃で溶解させ、物質(6)〜(9)を同じ温度で溶解させた。物質(6)〜(9)を物質(1)〜(5)に乳化させ、粗抽出物を10.0重量%、1.0重量%、0.1重量%、0.01重量%の濃度でそれぞれ添加して再混合した後、最後に香料を添加して精製水で定量を合わせた。実施例11〜14:キサントリゾールを含有する化粧水の製造 キサントリゾールを使用して、実施例11〜14の組成を有する化粧水を製造した。キサントリゾールを5.0重量%、0.1重量%、0.01重量%、0.001重量%の4種の濃度にして、それぞれ水に溶解させてリン酸水溶液と混合した。エタノール、グリセリン、プロピレングリコールを混合して前記混合物に添加して混合しながら、香料、保存料を追加して水で重量を調整して均一に混和させた。実施例15〜18:キサントリゾールを含有するクリームの製造 キサントリゾールを使用して、実施例15〜18の組成を有するクリームを製造した。まず、表5に示す物質(1)〜(5)は75〜80℃で溶解させ、物質(6)〜(9)を同じ温度で溶解させた。物質(6)〜(9)を物質(1)〜(5)に乳化させ、キサントリゾールを5.0重量%、0.1重量%、0.01重量%、0.001重量%の濃度でそれぞれ添加して再混合した後、最後に香料を添加して精製水で定量を合わせた。試験例5:クルクマ・キサントリーザ抽出物含有組成物のコラーゲン合成量のインビボ(in vivo)での測定 ヌードマウス(hairless mouse)に紫外線20mJ/cm2を4週間毎日1回照射し、前記実施例3〜10のクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物含有組成物を、それぞれ4週間毎日100mlずつ背部位に塗布した後、生検して組織学的にコラーゲンの形成を測定した。この時、新たに生成されるコラーゲン量の測定は、組織を免疫染色した後、これを画像分析を介して測定した。その結果を下記表6に示す。 前記表6に示した通り、クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物の含量が、増加するほどコラーゲン合成量が増加し、化粧水よりクリームの方がさらに高い活性を示すことを確認できた。これは化粧水よりクリームの方が皮膚における残存力がより高いためと判断される。試験例6:キサントリゾール含有組成物のコラーゲン合成量のインビボ(in vivo)での測定 ヌードマウス(hairless mouse)に紫外線20mJ/cm2を4週間毎日1回照射し、前記実施例11〜18のキサントリゾール含有組成物を、それぞれ4週間毎日100mlずつ背部位に塗布した後、生検して組織学的にコラーゲンの形成を測定した。この時、新たに生成されるコラーゲン量の測定は、組織を免疫染色した後、これを画像分析を介して測定した。その結果を下記表7に示す。 前記表7に示した通り、キサントリゾールの含量が、増加するほどコラーゲン合成量が増加され、化粧水よりクリームの方がさらに高い活性を示すことを確認できた。これは化粧水よりクリームの方が皮膚における残存力がより高いためと判断される。 化学式1で示されるキサントリゾール(xanthorrhizol)を有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物。 化学式1で示されるキサントリゾールの皮膚皺改善用製剤の製造のための使用。 化学式1で示されるキサントリゾールのコラーゲン合成誘導剤の製造のための使用。 化学式1で示されるキサントリゾールのコラーゲン分解抑制剤の製造のための使用。 化学式1で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法。 化学式1で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン合成誘導方法。 化学式1で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン分解抑制方法。 クルクマ・キサントリーザ(Curcuma xanthorrhiza)の抽出物を有効成分とする皮膚皺改善用組成物。 クルクマ・キサントリーザ抽出物の皮膚皺改善用製剤の製造のための使用。 クルクマ・キサントリーザ抽出物のコラーゲン合成誘導剤の製造のための使用。 クルクマ・キサントリーザ抽出物のコラーゲン分解抑制剤の製造のための使用。 クルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法。 クルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン合成誘導方法。 クルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン分解抑制方法。 本発明は、クルクマ・キサントリーザ(Curcuma xanthorrhiza)の抽出物、またはその抽出物から単離した化学式1で示されるキサントリゾール(xanthorrhizol)の新規使用に関するものである。本発明のクルクマ・キサントリーザの抽出物、またはキサントリゾールはコラーゲン分解酵素−1(MMP−1,マトリクス・メタロプロテイナーゼ−1;matrix metalloproteinase-1)の抑制能力、及び新生コラーゲン(タイプ−1・プロコラーゲン;type-1 procollagen)合成能力を有し、皺を改善させる効果を有する。従って、本発明のクルクマ・キサントリーザの抽出物またはキサントリゾールは、光老化で形成される皺の治療または予防に極めて有用に使用し得る。


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