生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_組換えＡＡＶ生産の効率を上昇させる方法 |
| 出願番号： | 2007282522 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12N 7/00,C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
リチャード ジェイ． サムルスキー シャオ シャオ リチャード スナイダー JP 2008043349 公開特許公報(A) 20080228 2007282522 20071030 組換えＡＡＶ生産の効率を上昇させる方法 セル ジェネシス インコーポレイテッド 597078983 ザ ユニバーシティー オブ ノースカロライナ アット チャペル ヒル 501378929 山本 秀策 100078282 安村 高明 100062409 森下 夏樹 100113413 リチャード ジェイ． サムルスキー シャオ シャオ リチャード スナイダー US 60/043,547 19970414 C12N 7/00 20060101AFI20080201BHJP C12N 15/09 20060101ALN20080201BHJP JPC12N7/00C12N15/00 A 1 1998544283 19980414 ＯＬ 43 4B024 4B065 4B024AA01 4B024CA02 4B024CA11 4B024DA03 4B024EA02 4B024FA20 4B024GA11 4B024HA17 4B065AA95X 4B065AA95Y 4B065AB01 4B065CA44本発明によって、以下が提供される： 図１：ＡＡＶ ヘルパープラスミドの構築。プラスミドＡＡＶ／ＡＤおよびＡＣＧ−２は、内因性ｐ５プロモーター（白のボックスで示す）を含み、プラスミド ＣＭＶ／ＡＡＶ、ＨＩＶ／ＡＡＶおよびＳＶ／ＡＡＶは、元のｐ５プロモーターに代わる異種プロモーター（影付きのボックスで示す）を含む。全ての構築体は、同じＡＡＶコード配列すなわちＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子（影付きボックス中に図示）を含む。ただし、構築体ＡＣＧ−２は、Ｒｅｐの翻訳開始コドンにおいてＡＴＣがＡＣＧに変異している。図２：種々のＡＡＶヘルパープラスミドからのＲｅｐ遺伝子発現のウエスタン分析。Ａｄ感染を行わずに（レーン１〜５）またはＡｄ感染を行って（レーン６〜１０）、プラスミドＡＡＶ／ＡＤ（レーン１および６）、ＡＣＧ−２（レーン２および７）、ＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン３および８）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン４および９）およ びＳＶ／ＡＡＶ（レーン５および１０）を２９３細胞にトランスフェクトした。細胞分解産物のサンプルを１０％ＰＡＧＥにより分離した。４種のＲｅｐタンパク質全てを認識する抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行った（Ｈｕｎｔｅｒら、１９９２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：３１７−３２４）。図３：ｒＡＡＶ ＤＮＡ複製のサザン分析。ＡＡＶベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、アデノウイルス感染を行わずに（レーン１、２、５、６）またはアデノウイルス 感染を行って（レーン３、４、７、８）、ヘルパープラスミドＣＶＭ／ＡＡＶ（レーン１〜４）またはＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン５〜８）と共に２９３細胞に同時 トランスフェクトした。低分子量ＤＮＡを細胞から回収し、予めＤｐｎＩで消化せずに（レーン１、３、５、７）またはＤｐｎＩで消化してから（レーン２、 ４、６、８）、１％アガロースゲルで分離した。３２Ｐ標識ＬａｃＺプローブ（２．１ｋｂ ＣｌａＩ／ＮｄｅＩ断片）を用いてサザンブロットを行った。図４： 異なるヘルパープラスミドでトランスフェクトした細胞におけるｒＡＡＶ ＤＮＡ複製の比較。ＡＡＶベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、Ａｄ感染を行って、ヘルパープラスミドＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン１および２）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン３および４）、ＳＶ／ＡＡＶ（レーン５および６）、ＡＡＶ／ＡＤ（レーン７および８）およびＡＣＧ−２（レーン９および０１）と共 に２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後（レーン１、３、５、７および９）または４８時間後（レーン２、４、６、８お よび１０）に細胞から低分子量ＤＮＡを回収した。３２Ｐ標識ＬａｃＺプローブ（２．１ｋｂ Ｃｌａ Ｉ／Ｎｄｅ Ｉ断片）を用いてサザンブロットを行った。図５：各種のＡＡＶヘルパープラスミドからのＣａｐ遺伝子発現のウェスタン分析。ＡＡＶ ベクタープラスミドｐｄｘ３１−ＬａｃＺを、Ａｄ感染を行って（レーン１〜５）またはＡｄ感染を行わずに（レーン６〜１０）、ヘルパープラスミド ＣＭＶ／ＡＡＶ（レーン１および６）、ＨＩＶ／ＡＡＶ（レーン２および７）、ＳＶ／ＡＡＶ（レーン３および８）、ＡＡＶ／ＡＤ（レーン４および９）および ＡＣＧ−２（レーン５および１０）と共に２９３細胞に同時トランスフェクトした。１０％ＰＡＧＥにより細胞溶解産物のサンプルを分離した。３種のＣａｐタ ンパク質全てを認識する抗−Ｃａｐポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。本願明細書等に記載されるような、組換えＡＡＶ生産の効率を上昇させる方法。 【課題】組換えアデノ随伴ウイルスのストックの生産における従来技術上の課題を解決する手段の提供。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルスのストックを生産する方法であって、a) AAV REPタンパク質を野生型レベルより低いレベルで発現しかつアデノ随伴ウイルスの複製を可能にする細胞を、i)外来DNA配列を含みかつ感染性AAV ビリオンに組み込むことができる組換えアデノ随伴ウイルスベクターと、ii)該組換えアデノ随伴ウイルスベクターの複製および感染性ビリオンへのパッケ ージングにとって十分なウイルス機能を提供する組換えヘルパーアデノ随伴ウイルスDNAとで同時トランスフェクトし、そしてb) 産生されたビリオンを回収する、 ことを含んでなる方法。 【選択図】なし