生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９の配列、それを含むベクターおよびその使用 |
| 出願番号： | 2003552919 |
| 年次： | 2011 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C07K 14/015,C12N 5/10,C12N 7/00 |
特許情報キャッシュ
ガオ，グアングピング ウイルソン，ジエイムズ・エム アルビラ，モーリシオ JP 4769417 特許公報(B2) 20110624 2003552919 20021112 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９の配列、それを含むベクターおよびその使用 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 502409813 特許業務法人小田島特許事務所 110000741 ガオ，グアングピング ウイルソン，ジエイムズ・エム アルビラ，モーリシオ US 60/341,150 20011217 US 60/386,132 20020605 20110907 C12N 15/09 20060101AFI20110818BHJP C07K 14/015 20060101ALI20110818BHJP C12N 5/10 20060101ALI20110818BHJP C12N 7/00 20060101ALI20110818BHJP JPC12N15/00 AC07K14/015C12N5/00 102C12N7/00 C12N 15/09 GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq SwissProt/PIR/GeneSeq JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) PubMed BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) 特開２００３−２３５５６２（ＪＰ，Ａ） 国際公開第００／０２８０６１（ＷＯ，Ａ１） Mol. Ther., 2006年, vol. 14, no. 1, p. 45-53 9 US2002033631 20021112 WO2003052052 20030626 2005522994 20050804 52 20051025 光本 美奈子 パルボウイルス科の員であるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）から６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを持つ小さな、包膜をもたない正二十面ウイルスである。ＡＡＶはこのウイルスが精製されたアデノウイルスストック中の混入物として発見されたのでディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に分類される。ＡＡＶの生活環は、感染後にＡＡＶゲノムが宿主の染色体に部位特異的に組み込まれる潜伏期、およびアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスの感染後に、組み込まれたゲノムが引き続きレスキューされ、複製され、そして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期を含む。非病原性であり、非分割細胞を含む感染の広い宿主範囲、および潜在的な部位特異的染色体組込みにより、ＡＡＶは遺伝子転移の魅力的な道具である。 最近の研究では、ＡＡＶベクターが遺伝子送達の好適な媒介物となり得ることが示唆されている。今日まで、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から６種の血清型のＡＡＶが単離され、そして十分に特性決定された。それらの中で、ヒト血清型２は遺伝子転移ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり；これは種々の標的組織および動物モデルにおいて、効率的な遺伝子転移実験に広く使用されてきた。ＡＡＶ２に基づくベクターを幾つかのヒトの疾患モデルへ実験的に応用する臨床的試験が進行中であり、そして嚢胞性繊維症および血友病Ｂのような疾患を含む。 望まれるものは遺伝子送達用のＡＡＶに基づく構築物である。発明の要約 １つの観点では、本発明は新規ＡＡＶ配列、これらの配列を含む組成物およびそれらの使用を提供する。有利にはこれらの組成物は治療または予防目的にｒＡＡＶの再投与を要する組成物での使用に特に良く適している。 本発明のこれらおよび他の観点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかになるだろう。発明の詳細な説明 本発明は、新規ＡＡＶ血清型であるＡＡＶ９の核酸配列およびアミノ酸を提供する。またこれらＡＡＶ配列のフラグメントも提供する。これら各フラグメントは種々のベクター系および宿主細胞で直ちに利用することができる。中でも望ましいＡＡＶ９フラグメントはｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらタンパク質をコードする配列である。これらのフラグメントは種々のベクター系および宿主細胞で直ちに利用することができる。そのようなフラグメントは単独で、他のＡＡＶ９配列もしくはフラグメントと組み合わせて、または他のＡＶＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列に由来する要素と組み合わせて使用することができる。１つの特に望ましい態様では、ベクターは本発明のＡＡＶ９ｃａｐおよび／またはｒｅｐ配列を含む。 ＡＡＶ９配列およびそのフラグメントはｒＡＡＶの生産に有用であり、そしてアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターまたはワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび本発明のＡＡＶ９配列を含む宿主細胞を提供する。 適当なフラグメントは本明細書に提供する情報を使用して決定することができる。アライメントはインターネット上のウェブサーバーを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」のように様々に公開または市販されて利用可能なマルチプルシークエンスアライメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して行う。あるいはベクター ＮＴＩユーティリティ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）も使用する。ヌクレオチド配列の同一性の測定するために使用することができる、当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムがあり、それらには上記のプログラムに含まれるものを含む。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＦａｓｔａ、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムを使用して比較することができる。Ｆａｓｔａはクエリとサーチ配列との間で最高の重複領域のアライメントおよび配列同一性の割合を提供する。例えば核酸配列間の配列同一性の割合は、引用により本明細書に編入するＧＣＧバージョン６．１に提供されているように、そのデフォルトパラメーター（６のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスについてはＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦａｓｔａを使用して決定することができる。同様なプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」プログラムがアミノ酸アライメントを行うために利用可能である。一般にこれらのプログラムはデフォルト設定で使用するが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。あるいは当業者は参照にしたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。 核酸またはそのフラグメントを指す時、用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、適切なヌクレオチド挿入または欠損が別の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約９５〜９９％にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのオープンリーディングフレイム、または少なくとも１５個のヌクレオチド長である他の適当なフラグメントである。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。 アミノ酸またはそのフラグメントを指す時、用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」とは、適切なアミノ酸挿入または欠損が別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約９５〜９９％にアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのタンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または少なくとも８個のアミノ酸、またはより望ましくは少なくとも１５個のアミノ酸長であるそのフラグメントにわたる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。 用語「高度に保存された」とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の同一性、そしてより好ましくは９７％より高い同一性を意味する。同一性は当業者に知られているアルゴリズムおよびコンピュータープログラムにより当業者が容易に決定できる。 核酸配列の内容において「同一性の割合」または「同一の」という用語は、最大の対応について並べた時、２つの配列中で同じ残基を指す。配列同一性の比較の長さは、完全長のゲノム、完全長の遺伝子コード配列にわたることができ、または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしより小さいフラグメント間、例えば少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０〜２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチド間の同一性も望ましくなり得る。同様に「配列同一性の割合」は完全長のタンパク質またはそのフラグメントにわたるアミノ酸配列について容易に決定することができる。適当にはフラグメントは少なくとも約８個のアミノ酸長であり、そして最高約７００個のアミノ酸であることができる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。 本明細書に記載するように、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のＡＡＶ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの効力を減少させる応用に特に良く適している。本発明のｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ再投与および反復遺伝子治療に特に有利である。 本発明のこれらのおよび他の態様および利点は、これからさらに詳細に記載する。本明細書および特許請求の範囲を通して使用する用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、他の成分、要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）、工程等を含むことができる。逆に用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」およびその変形は、他の成分、要素、完全体、工程等を含まない。Ｉ．ＡＡＶ血清型９の配列Ａ．核酸配列 本発明のＡＡＶ９の核酸配列は、４３８２ヌクレオチドからなる図１［配列番号１］のＤＮＡ配列を含む。本発明のＡＡＶ９の核酸配列はさらに図１［配列番号１］に相補的である鎖、ならびに図１［配列番号１］およびその相補鎖に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。また本発明の核酸配列に含まれるのは、図１［配列番号１］およびその相補鎖の天然の変異体および工作した修飾である。そのような修飾には例えば当該技術分野で知られている標識、メチル化および１以上の自然に存在するヌクレオチドと縮重ヌクレオチドとの置換を含む。 さらに本発明に含まれるのは、図１［配列番号１］より８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％高く、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一または相同的である核酸配列である。また本発明に含まれるのは、図１［配列番号１］のフラグメント、その相補鎖、それらに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡである。適当なフラグメントは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、そして機能的フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは選択的スプライスバリアント：ｖｐ１［図１、配列番号１のｎｔ２１１６〜４３２３］；ｖｐ２［図１、配列番号１のｎｔ２５２７〜４３２３］；およびｖｐ３［図１、配列番号１のｎｔ２７２５〜４３２３］であるＡＡＶ９キャプシドの３つの可変タンパク質（ｖｐ）をコードする配列を含む。図１、配列番号１の他の適当なフラグメント、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質の出発コドンを含むフラグメント。 さらに別のフラグメントには、ｒｅｐ７８［図１のｎｔ２２８に位置する開始コドン］、ｒｅｐ６８［図１のｎｔ２２８に位置する開始コドン］、ｒｅｐ５２［図１のｎｔ９００に位置する開始コドン］およびｒｅｐ４０［図１のｎｔ９００に位置する開始コドン］を含むｒｅｐタンパク質をコードするものを含む。配列番号１を参照にされたい。他の興味深いフラグメントには、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）、ＡＡＶ Ｐ１９配列、ＡＡＶ Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位およびターミナル リゾルート サイト（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｅ ｓｉｔｅ：ＴＲＳ）を含むことができる。さらに他の適当なフラグメントが当業者には直ちに明らかとなるだろう。 図面および配列表に提供する核酸配列を含むことに加えて、本発明は本発明のＡＡＶ血清型のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチドを発現するように設計された核酸分子および配列を含む。すなわち本発明は以下の新規ＡＡＶアミノ酸配列およびこれらの配列および／またはその独自なフラグメントを使用して生成された人工ＡＡＶ血清型をコードする核酸配列を含む。 本明細書で使用する人工ＡＡＶ血清型には限定するわけではないが、自然には存在しないキャプシドタンパク質を持つＡＡＶを含む。そのような人工的キャプシドは本発明の新規ＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）から、同じＡＡＶ血清型の非連続部分から、非ＡＡＶウイルス供給源から、または非ウイルス供給源から得ることができるヘテロロガスな配列と組み合わせて使用して、任意の適切な技術により生成することができる。人工ＡＡＶ血清型には限定するわけではないが、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシドまたは「ヒト化」ＡＡＶキャプシドでよい。Ｂ．ＡＡＶ９アミノ酸配列、タンパク質およびペプチド 本発明はさらに本発明のＡＡＶ９核酸によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、および他の方法により生成されるＡＡＶ９アミノ酸を提供する。本発明はさらに合成、組換えまたは当業者に既知の他の技術を使用して生成される本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を使用して生成されるＡＡＶ血清型を包含する。本発明は本発明の新規なＡＡＶ核酸配列から発現される新規ＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質に限定されず、そして例えば化学合成により、他の合成技法により、または他の方法によることを含む当該技術分野で既知な他の方法により生成されるアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質を包含する。例えば任意の配列が種々の技術を使用して容易に生成される。 適切な生産技法は当業者には周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー出版（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）を参照にされたい。あるいはペプチドは周知な固相ペプチド合成法により合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サンフランシスコ、１９６９）第２７〜６２頁）。これらのおよび他の適当な生産法は当業者の知識内であり、そして本発明を限定しない。 特に望ましいタンパク質には、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質およびＡＡＶ９ｒｅｐタンパク質を含む。 特に望ましいタンパク質には上で確認したヌクレオチド配列によりコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。ＡＡＶキャプシドは選択的スプライス変異体である３つのタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３を含んでなる。図２に提供される完全長の配列はｖｐ１の配列である。ＡＡＶ９キャプシドタンパク質にはｖｐ１［配列番号２］、ｖｐ２［配列番号２のａａ１３８〜７３６］、およびｖｐ３［配列番号２のａａ２０３〜７３６］およびそれらの機能的フラグメントを含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントは、超可変領域（ＨＰＶ）間に位置する定常および可変領域を含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントにはＨＰＶ自体を含む。 ＡＡＶ２における配列多様性の領域を決定するために開発されたアルゴリズムでは、１２の超可変領域（ＨＶＲ）を生じ、その５個が重複するか、または４個の以前に記載された可変領域の一部である［Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７２：３０９−３１９］。このアルゴリズムおよび／または本明細書に記載するアライメント技術を使用して、新規ＡＡＶ血清型のＨＶＲを決定する。例えばＡＡＶ２ ｖｐ１［配列番号４］の番号に関して、ＨＶＲは以下のように位置する：ＨＶＲ１、ａａ１４６〜１５２；ＨＶＲ２ ａａ１８２〜１８６；ＨＶＲ３、ａａ２６２〜２６４；ＨＶＲ４、ａａ３８１〜３８３；ＨＶＲ５、ａａ４５０〜４７４；ＨＶＲ６、ａａ４９０〜４９５；ＨＶＲ７、ａａ５００〜５０４；ＨＶＲ８、ａａ５１４〜５２２；ＨＶＲ９、ａａ５３４〜５５５；ＨＶＲ１０、ａａ５８１〜５９４；ＨＶＲ１１、ａａ６５８〜６６７；およびＨＶＲ１２、ａａ７０５〜７１９。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘプログラムをデフォルト設定で使用して行う本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の市販されているか、もしくは公に利用可能なアライメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者は本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定することができる。 ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のさらに他の望ましいフラグメントには、配列番号２のアミノ酸１〜１８４、配列番号２のアミノ酸１９９〜２５９；アミノ酸２７４〜４４６；アミノ酸６０３〜６５９；アミノ酸６７０〜７０６；アミノ酸７２４〜７３６；ａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３を含む。さらにＡＡＶキャプシドの他の適当なフラグメントの例には、ＡＡＶ２［配列番号４］の番号付けで、ａａ２４〜４２、ａａ２５〜２８；ａａ８１〜８５；ａａ１３３〜１６５；ａａ１３４〜１６５；ａａ１３７〜１４３；ａａ１５４〜１５６；ａａ１９４〜２０８；ａａ２６１〜２７４；ａａ２６２〜２７４；ａａ１７１〜１７３；ａａ４１３〜４１７；ａａ４４９〜４７８；ａａ４９４〜５２５；ａａ５３４〜５７１；ａａ５８１〜６０１；ａａ６６０〜６７１；ａａ７０９〜７２３を含む。さらに他の望ましいフラグメントには例えばＡＡＶ７中の配列番号２のアミノ酸１〜１８４、アミノ酸１９９〜２５９；アミノ酸２７４〜４４６；アミノ酸６０３〜６５９；アミノ酸６７０〜７０６；アミノ酸７２４〜７３６；ａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３を含む。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘプログラムをデフォルト設定で使用して行う本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の市販されているか、もしくは公に利用可能なアライメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者は本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定することができる。 さらに他の望ましいＡＡＶ９タンパク質には、ｒｅｐ６８／７８およびｒｅｐ４０／５２［配列番号３内に位置する］を含むｒｅｐタンパク質を含む。ｒｅｐタンパク質の適当なフラグメントには配列番号３のａａ１〜１０２；ａａ１０３〜１４０；ａａ１４１〜１７３；ａａ１７４〜２２６；ａａ２２７〜２７５；ａａ２７６〜３７４；ａａ３７５〜３８３；ａａ３８４〜４４６；ａａ４４７〜５４２；ａａ５４３〜５５５；ａａ５５６〜６２３を含むことができる。 適当にはフラグメントは少なくとも８アミノ酸長である。しかし他の望ましい長さのフラグメントを容易に利用することができる。そのようなフラグメントは組換えで、または他の適当な手段、例えば化学合成により生成することができる。 本発明はさらに本明細書に提供する配列情報を使用して同定される他のＡＡＶ９配列を提供する。例えば本明細書に提供する上記ＡＡＶ９配列、感染性ＡＡＶ９はゲノムウォーキング技術（Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１０８７−１０８８，Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア州）を使用して単離することができる。ゲノムウォーキングは、本発明の方法に従い同定される新規配列に隣接する配列の同定および単離に特によく適している。この技術は本明細書に提供する新規ＡＡＶキャプシドおよびｒｅｐ配列に基づき、新規ＡＡＶ９血清型の逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を単離するためにも有用である。 本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え生産、化学合成または他の合成手段を含む任意の適当な手段により生産することができる。そのような生産法は当業者の知識の範囲内であり、そして本発明を限定しない。ＩＶ．ＡＡＶ９キャプシドを持つｒＡＡＶの生産 本発明は新規な野生型ＡＡＶ９を包含し、その配列はこれらウイルスが天然に付随するＤＮＡおよび／または細胞物質を含まない。別の観点では、本発明は標的細胞にヘテロロガスな遺伝子または他の核酸配列を送達するのに有用な分子の生産に、本発明の新規ＡＡＶ配列（そのフラグメントを含む）を利用する分子を提供する。 別の観点では本発明は標的細胞にヘテロロガスな遺伝子または他の核酸配列を送達するのに有用なウイルスベクターの生産に、本発明の新規ＡＡＶ９配列（そのフラグメントを含む）を利用する分子を提供する。 ＡＡＶ９配列を含む本発明の分子は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝的要素（ベクター）、例えばその上に持つ配列を転移する裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス性の送達媒体（例えば脂質に基づく担体）中のタンパク質、ウイルス等を含む。選択したベクターはトランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡ−コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適当な方法により送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用する方法は核酸操作の技術を持つ者に知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。 １つの態様では、本発明のベクターは最低限ＡＡＶ９キャプシドまたはそのフラグメントをコードする配列を含む。別の態様では、本発明のベクターは最低限ＡＡＶ９ｒｅｐタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を含む。場合によりそのようなベクターはＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐタンパク質の両方を含むことができる。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの両方が提供されるベクターでは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ配列が両方ともＡＡＶ９起源であることができる。あるいは本発明はｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供している血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来するベクターを提供する。１つの態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別の供給源（例えば別のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現される。別の態様では、これらｒｅｐ配列は異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とフレイム内で融合して、キメラＡＡＶベクターを形成する。場合により本発明のベクターはさらにＡＡＶ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲに挟まれた選択した導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子を含む。 このように１つの態様では、本明細書に記載するベクターは単一のＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ９）に由来することができる完全なＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列を含む。そのようなキャプシドは配列番号２のアミノ酸１〜７３６を含んでなることができる。あるいはこれらのベクターはヘテロロガスなＡＡＶまたは非ＡＡＶキャプシドタンパク質（またはそれらのフラグメント）に融合したＡＡＶ９キャプシドの１以上のフラグメントを含む人工キャプシドをコードする配列を含む。これらの人工キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドの非連続部分から、または他のＡＡＶ血清型のキャプシドから選択される。例えばｒＡＡＶはｖｐ２および／もしくはｖｐ３から、またはｖｐ１から選択される１以上のＡＡＶ９キャプシド領域を含んでなるキャプシドタンパク質、またはＡＡＶ９キャプシド、配列番号２のアミノ酸１〜１８４、アミノ酸１９９〜２５９；アミノ酸２７４〜４４６；アミノ酸６０３〜６５９；アミノ酸６７０〜７０６；アミノ酸７２４〜７３６から選択されるそれらのフラグメントを有することができる。別の例では、ｖｐ３タンパク質の開始コドンをＧＴＧに改変することが望ましいかもしれない。あるいはｒＡＡＶは、本明細書で同定される１以上のＡＡＶ血清型９のキャプシドタンパク質超可変領域、または限定するわけではないがＡＡＶ９キャプシドのａａ１８５〜１９８；ａａ２６０〜２７３；ａａ４４７〜４７７；ａａ４９５〜６０２；ａａ６６０〜６６９；およびａａ７０７〜７２３を含む他のフラグメントを含んでもよい。配列番号２を参照にされたい。これらの修飾は発現、収量を上げ、かつ／または選択した発現系における精製を向上させ、あるいは別の所望する目的（例えばトロピズムを変えるか、または中和抗体エピトープを改変する）とすることができる。 本明細書に記載するベクター、例えばプラスミドは様々な目的に有用であるが、特にＡＡＶ配列またはそのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するｒＡＡＶの生産での使用に良く適している。ｒＡＡＶを含むこれらのベクター、それらの要素、構築および使用を本明細書に詳細に記載する。 １つの観点では、本発明はＡＡＶ血清型９キャプシドまたはその部分を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成法を提供する。そのような方法には本明細書で定義するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；最低限ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；およびミニ遺伝子をＡＡＶ９キャプシドタンパク質にパッケージングすることを可能とする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。 ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶキャプシドへパッケージングするために、宿主細胞で培養されることが必要な要素は、宿主細胞にトランスで提供され得る。あるいは必要な要素の１以上（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）は、当業者に知られている方法を使用して１以上の必要な要素を含むように工作した安定な宿主細胞により提供され得る。最も適当には、そのような安定な宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下に必要な要素（１つまたは複数）を含む。しかし必要な要素（１つまたは複数）は構成的プロモーターの制御下でもよい。適当な誘導性および構成的プロモーターの例は本明細書において導入遺伝子を用いた使用に適する調節要素の考察で提供する。さらに別の選択では、選択した安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下に選択した成分（１つまたは複数）を、そして１以上の誘導性プロモーターの制御下に他の選択した成分（１つまたは複数）を含むことができる。例えば、２９３細胞（これはＥ１ヘルパー機能を構成的プロモーターの制御下に含む）に由来するが、ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を誘導性プロモーターの制御下に含む安定な宿主細胞を作成することができる。さらに別の安定な宿主細胞を当業者は作成することができる。 本発明のｒＡＡＶを生産するために必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、その上に持つ配列を移す任意の遺伝的要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択した遺伝的要素は本明細書に記載する方法を含む任意の適当な方法により送達され得る。本発明の任意の態様を構成するために使用する方法は、核酸操作における当業者には知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。同様にｒＡＡＶビリオンの作成法も周知であり、そして適当な方法の選択が本発明を限定することはない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照にされたい。 特に言及しない限り、本明細書に記載するＡＡＶ ＩＴＲｓおよび他の選択したＡＡＶ成分は限定するわけではないがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７および本発明の新規血清型ＡＡＶ９を含む任意のＡＡＶ血清型の中から容易に選択することができる。これらのＩＴＲｓまたは他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶ血清型から当業者が利用可能な技術を使用して容易に単離され得る。そのようなＡＡＶは学術的、市販の、または公的な供給源（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州）から単離または得ることができる。あるいはＡＡＶ配列は、技術文献またはＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄ等のようなデーターベースから利用できるような公開された配列を参照にすることにより、合成または適当な手段を通して得ることができる。Ａ．ミニ遺伝子 ミニ遺伝子は最低限、導入遺伝子およびその調節配列、および５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を含んでなる。１つの望ましい態様では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲｓを使用する。しかし他の適当な血清型に由来するＩＴＲｓも選択することができる。このミニ遺伝子はキャプシドタンパク質にパッケージングされ、そして選択した宿主細胞に送達される。１．導入遺伝子 導入遺伝子は、問題のポリペプチド、タンパク質または他の産物をコードする導入遺伝子を挟むベクター配列にヘテロロガスな核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で調節成分に操作可能に連結される。 導入遺伝子配列の組成は、生成するベクターに課される使用に依存するだろう。例えば導入遺伝子配列の１つの種類はレポーター配列を含み、これは発現により検出可能なシグナルを生産する。そのようなレポーター配列には限定するわけではないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集タンパク質、および当該技術分野で周知の他のもの（これらに対する高親和性抗体が存在するか、あるいは通例の手段により生成することができる）、ならびに中でもとりわけ赤血球凝集素またはＭｙｃに由来する抗原のタグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。 これらのコード配列はそれらの発現を駆動する調節要素と会合した時、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティングアッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えばマーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを持つベクターの存在は、ベータガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを持つベクターはルミノメーター中での色または光の生産により視覚的に測定することができる。 しかし望ましくは、導入遺伝子はタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素または触媒ＲＮＡのような生物学および医学で有用な産物をコードする非マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子にはｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の１例は、処置する動物中で標的核酸配列の発現を無効にする配列である。 導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常レベルよりも低く発現される欠損、または機能的な遺伝子産物が発現されない欠損を含み得る遺伝子欠損を矯正するか、または軽減するために使用することができる。好適な種類の導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現する治療用タンパク質またはペプチドをコードする。本発明はさらに、例えば多サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝子欠失を矯正するか、または改善するために多数の導入遺伝子を使用することを含む。特定の状況ではタンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチドまたはタンパク質をコードするために種々の導入遺伝子を使用することができる。これはタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい時、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子またはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞を異なる各サブユニットを含む組換えウイルスに感染させる。あるいはタンパク質の種々のサブユニットが同じ導入遺伝子によりコードされてもよい。この場合、１つの導入遺伝子が各サブユニットをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットのＤＮＡは内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）により分けられている。これは各サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが小さい時、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの全サイズが５キロベース未満である時に望ましい。ＩＲＥＳに対する代わりとして、ＤＮＡは２Ａペプチド（これは翻訳後反応（ｅｖｅｎｔ）で自己開裂する）をコードする配列により分けられてもよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８（Ｐｔ１）：１３−２１（Ｊａｎ１９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照にされたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳよりも有意に小さく、スペースが限定因子となる時の使用によく適している。しかし選択した導入遺伝子は任意の生物学的に活性な産物または他の産物、例えば研究に望ましい産物もコードすることができる。 適切な導入遺伝子は当業者により容易に選択され得る。導入遺伝子の選択が本発明を限定するとは考えられない。２．調節要素 ミニ遺伝子に関して上記で確認した主要な要素に加えて、ベクターは本発明により生産されたプラスミドベクターでトランスフェクトした、またはウイルスに感染した細胞での転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で導入遺伝子に操作可能に連結された、通常の必要な制御要素も含む。本明細書で使用するように「操作可能に連結した」配列には、問題の遺伝子に連続する発現制御配列、およびトランスで、つまり一定の距離を離れて作用して問題の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。 発現制御配列には適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニレーション（ポリＡ）シグナルのような効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわちＫｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および所望により、コードされた産物の分泌を強化する配列を含む。天然の、構成的な、誘導性のおよび／または組織特異的なプロモーターを含む莫大な数の発現制御配列が当該技術分野では知られており、そして利用することができる。 構成的プロモーターの例には限定するわけではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）［例えばＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照にされたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を含む。 誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、そして外から供給される化合物、温度のような環境的因子、または特別な生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、あるいは複製している細胞のみで調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定するわけではないがインビトロゲン、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびアリアド（Ａｒｉａｄ）を含む様々な商業的供給源から入手することができる。多くの他の系が記載され、そして当業者により容易に選択され得る。外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例には、例えば亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン−抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン−誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）を参照にされたい］、ＲＵ４８６−誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］およびラパマイシン−誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を含む。この内容において有用となり得る誘導性プロモーターの他の例には、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターを含む。 別の態様では、導入遺伝子に天然のプロモーターを使用する。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模するべきであることが望まれる時に好適となり得る。天然のプロモーターは導入遺伝子の発現が一時的にもしくは発育的に、または組織特異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用することができる。さらなる態様では、エンハンサーエレメント、ポリアデニレーション部位またはＫｏｚａｋ共通配列のような他の天然の発現制御要素を使用して、天然の発現を模することもできる。 導入遺伝子の別の態様には、組織−特異的プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現が望まれる場合、筋肉中で活性なプロモーターを使用するべきである。これらには骨格筋β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成の筋肉プロモーターを含む（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９）を参照にされたい）。組織−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６））、骨のオステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６）），リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖）、ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターのような神経性（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽−鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン−特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））について知られている。 場合により治療的に有用な導入遺伝子を持つプラスミドは、中でもジェネティシン、ハイグロマイシンまたはプリマイシン耐性をコードする配列を含むことができる選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含んでもよい。そのような選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置する）を使用して、アンピシリン耐性のような細菌細胞中でのプラスミドの存在のシグナルを出すことができる。プラスミドの他の成分には、複製起点を含むことができる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は通例であり、そして多くのそのような配列を利用することができる［たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい］。 導入遺伝子、プロモーター／エンハンサーおよび５’および３’ＩＴＲｓの組み合わせは、本明細書で簡便性のために「ミニ遺伝子」と呼ぶ。本発明の教示によれば、そのようなミニ遺伝子の設計は通例の技術により作成することができる。３．ミニ遺伝子のパーケッジンング宿主細胞への送達 ミニ遺伝子は宿主細胞へ送達される任意の適当なベクター、例えばプラスミド上で運ぶことができる。本発明に有用なプラスミドは、それらが複製、そして場合により原核細胞、哺乳動物細胞または両方への組み込みに適当となるように工作することができる。これらのプラスミド（または５’ＡＡＶ ＩＴＲ−ヘテロロガス分子−３’ＩＴＲを持つ他のベクター）は、真核および／または原核細胞中でのミニ遺伝子の複製およびこれらの系に関する選択マーカーを可能とする配列を含む。選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子は、中でもジェネティシン、ハイグロマイシンまたはプリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を含むことができる。プラスミドはアンピシリン耐性のような細菌細胞中でのベクターの存在の信号を出すために使用できる特定の選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子を含むこともできる。プラスミドの他の成分には複製起点およびエプスタイン・バーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを含むことができる。このアンプリコン系または他の類似のアンプリコン成分は細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能とする。好ましくはミニ遺伝子を持つ分子は細胞にトランスフェクトされ、ここで一時的に存在することができる。あるいはミニ遺伝子（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−ヘテロロガス分子−３’ＩＴＲを持つ）は、染色体にまたはエピソームのいずれかとして宿主細胞のゲノムに安定に組込まれることができる。特定の態様では、ミニ遺伝子は場合により頭−対−頭、頭−対−尾または尾−対−尾のコンカテマーの多コピーで存在することができる。適当なトランスフェクション技術が知られており、そしてミニ遺伝子を宿主細胞に送達するために容易に利用することができる。 一般にミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する時、ベクターは約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、そして好ましくは約１０〜約５０μｇのＤＮＡから約１×１０４細胞〜約１×１０１３細胞、そして好ましくは約１０５細胞の量で送達される。しかし宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対的量は、選択するベクター、送達法および選択する宿主細胞のような因子を考慮して調整することができる。Ｂ．ＲｅｐおよびＣａｐ配列 ミニ遺伝子に加えて、宿主細胞は宿主細胞中でＡＡＶ９キャプシドタンパク質（またはＡＡＶ９キャプシドのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中に見いだされるＡＡＶ ＩＴＲｓの血清型と同じ血清型または交差−相補血清型のｒｅｐ配列を含む。ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ配列は上記のようにＡＡＶの供給源から独立して得ることができ、そして上記のように当該技術分野で知られている任意の既知の様式で宿主細胞に導入することができる。さらにＡＡＶ９キャプシド中のＡＡＶベクターをシュードタイプ化する時、必須の各ｒｅｐタンパク質をコードする配列はＡＡＶ９により供給されてもよく、またはｒｅｐタンパク質をコードする配列は異なるＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７）により供給されてもよい。例えばｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２に由来することができ、一方ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ１に由来することができる。 １つの態様では、宿主細胞は上記のような適当なプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含む。最も望ましくは、この態様ではキャプシドタンパク質が誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様ではキャプシドタンパク質は宿主細胞にトランスで供給される。宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質は宿主細胞で選択したキャプシドタンパク質の発現を支配するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達することができる。最も望ましくは宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質を持つプラスミドはｒＡＡＶをパーケッジンングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐ配列も持つ。 別の態様では、宿主細胞は上記のような適当なプロモーターの制御下にｒｅｐ配列を安定に含む。最も望ましくはこの態様では、必須なｒｅｐタンパク質が誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様では、ｒｅｐタンパク質は宿主細胞にトランスで供給される。宿主細胞にトランスで送達される時、ｒｅｐタンパク質は宿主細胞で選択したｒｅｐタンパク質の発現を支配するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達される。最も望ましくは宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質を持つプラスミドはｒＡＡＶをパーケッジンングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列も持つ。 このように１つの態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は１つの核酸分子で宿主細胞にトランスフェクトされ、そしてエピソープとして細胞中で安定に存在することができる。別の態様では、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞のゲノムに安定に組込まれる。別の態様は宿主細胞で一時的に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えばそのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に介在する任意のスペーサー、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子配列およびＡＡＶｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。 場合によりｒｅｐおよび／ｃａｐ配列は宿主細胞に導入される他のＤＮＡ配列を含むベクターで供給してもよい。例えばベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含むことができる。ベクターはヘルパー機能をコードする１以上の遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６、およびＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子を含んでなることができる。 好ましくはこの構築物に使用するプロモーターは、当業者に知られているか、または上記で検討した任意の構成的、誘導性または天然のプロモーターでよい。１つの態様ではＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列が使用される。任意のこれら配列を提供するためのＡＡＶの選択が本発明を限定することはない。 別の好適な態様では、ｒｅｐのプロモーターは多くが導入遺伝子の調節要素との関連で上に検討したような誘導性プロモーターである。ｒｅｐ発現の１つの好適なプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的または誘導的に発現するいずれかの細胞にトランスフェクトまたは形質転換される。例えば１９９８年３月１２日に公開された国際公開第９８／１００８８号パンフレットを参照にされたい。 スペーサーはベクターの設計における任意の要素である。スペーサーはプロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始部位との間に介在するＤＮＡ配列である。スペーサーは任意の所望する設計を有することができる；すなわちスペーサーはヌクレオチドのランダムな配列でよく、あるいはスペーサーはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは典型的には開始／終止およびポリＡ部位を包含する遺伝子を含むことができる。スペーサーは原核または真核生物に由来する非コードＤＮＡ配列、反復非コード配列、転写制御を含まないコード配列または転写制御を含むコード配列であることができる。２つの例示的なスペーサー配列源はλファージラダー配列または酵母ラダー配列であり、これらは例えば中でもギブコ（Ｇｉｂｃｏ）またはインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。スペーサーはｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物の発現を正常レベルにしたまま、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を下げるために十分な任意のサイズでよい。したがってスペーサーの長さは約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐの範囲、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲となり得る。組換えの可能性を減少させるために、スペーサーは好ましくは２ｋｂｐ長よりも短く；しかし発明を限定するものではない。 ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１つまたは複数）は宿主細胞に一時的に存在できるが（すなわちトランスフェクションを介して）、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の１つまたは両方およびそれらの発現を制御するプロモーター（１つまたは複数）が、宿主細胞中で例えばエピソームとして、または宿主細胞の染色体に組み込まれることにより安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構成するために使用する方法は、上記に引用した中に記載されるような通例の遺伝子工学または組換え工学技術である。この明細書では本明細書で提供する情報を使用して特別な構築物の具体例を提供するが、当業者は他の適当な構築物をスペーサー、Ｐ５プロモーターおよび少なくとも１つの翻訳開始および終止シグナル、および任意のポリアデニレーション部位の付加を含む他の要素の選択を使用して選択し、そして設計することができる。 本発明の別の態様では、ｒｅｐまたはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供され得る。Ｃ．ヘルパー機能 パッケージング宿主細胞も、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能を必要とする。場合によりこれらの機能は、ヘルペスウイルスにより供給される。最も望ましくは必要なヘルパー機能はそれぞれ、本明細書に記載するように、またはそしてＡＴＣＣを含む様々な供給源から入手可能であるようなヒトまたは非ヒト霊長類のアデノウイルス源から提供される。現在好適な１つの態様では、宿主細胞はＥ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／またはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物で供給されるか、かつ／またはそれらを含む。宿主細胞はＶＡＩ ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子も含むことができるが、これらの遺伝子は必要ではない。好適な態様では、宿主細胞に他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能は存在しない。 「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」とは、Ｅ１ａまたは任意の機能的Ｅ１ａタンパク質をコードする任意のアデノウイルス配列を意味する。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡも同様に定義する。またアデノウイルス遺伝子またはそれらの機能的部分の任意の対立遺伝子または他の修飾も含む。そのような修飾は幾つかの様式でアデノウイルス機能を強化するための通例の遺伝子工学または突然変異誘発技術により意図的に、ならびに自然に存在するそれらの対立遺伝子変異体により導入され得る。これらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためのそのような修飾およびＤＮＡの操作法は、当業者には知られている。 アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびに任意の他の所望するヘルパー機能は、細胞でそれらの発現を可能とする任意の手段を使用して提供することができる。これら産物をコードする各配列は別のベクター上に存在するか、または１以上の遺伝子が同じベクター上に存在してもよい。ベクターはプラスミド、コスミドおよびウイルスを含む当該技術分野で既知の、または上に開示した任意のベクターでよい。ベクターの宿主細胞への導入は、中でもトランスフェクション、感染、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ−コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む当該技術分野で既知の手段により、または上に開示したように達成することができる。１以上のアデノウイルス遺伝子を、エピソームとして安定に発現する宿主細胞のゲノムに安定に組込むか、または一時的に発現させることができる。遺伝子産物はエピソーム上で、または安定に組み込まれてすべてが一時的に発現されるか、あるいは遺伝子産物の幾つかが安定に発現されると同時に、他の産物は一時的に発現される。さらに各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択することができる。プロモーターは、例えば生物または細胞の特異的な生理学的状態（すなわち分化状態により、または複製中であるか、または静止細胞）、あるいは例えば外から加えられた因子により調節され得る。Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞系 宿主細胞自体は原核（例えば細菌）細胞、および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含む任意の生物から選択することができる。特に望ましい宿主細胞は限定するわけではないがＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、およびヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来する初代繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を含む任意の哺乳動物種から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず；哺乳動物細胞の種類、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等も本発明を限定しない。使用する細胞の要件は、細胞がＥ１、Ｅ２ａおよび／またはＥ４ＯＲＦ６以外のアデノウイルス遺伝子を持たず；細胞はｒＡＡＶの生産中に混入ウイルスの相同的組換えを生じる可能性がある他の任意の他のウイルス遺伝子を含まず；そして細胞はＤＮＡの感染またはトランスフェクション、およびトランスフェクトしたＤＮＡの発現を行うことができる。好適な態様では、宿主細胞は細胞に安定にトランスフェクトされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。 本発明に有用な１つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換され、そしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡおよび上記のミニ遺伝子を持つ構築物でトランスフェクトされた宿主細胞である。Ｂ−５０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３）または米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記載された細胞のような安定なｒｅｐおよび／またはｃａｐ発現細胞系も同様に使用することができる。別の望ましい宿主細胞はＥ４ＯＲＦ６を発現するために十分な最少のアデノウイルスＤＮＡを含む。さらに別の細胞系は、本発明のＡＡＶ９ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ９ｃａｐ配列を使用して構築することができる。 本発明に従い宿主細胞の調製には選択したＤＮＡ配列の集合のような技術を含む。この集合は、通常の技術を利用して行うことができる。そのような技術には周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（同上）に記載されているｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望のヌクレオチド配列を提供する他の適当な方法と組み合わせたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を含む。 分子（プラスミドまたはウイルスとして）の宿主細胞への導入も、当業者に既知の技術を使用して、そして本明細書を通して検討するように行うことができる。１つの態様では、標準的なトランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクションまたは電気穿孔、および／またはハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによるヒト胚性腎細胞系ＨＥＫ２９３（トランスに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含むヒト腎臓細胞系）のような細胞系への感染を使用する。 当業者により作成されるＡＡＶ９に基づく遺伝子治療ベクターは、ＡＡ９に対する中和抗体がヒトの群で見いだされていないので、選択した宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達に有益である。当業者は当業者に知られている様々な技術を使用して、本明細書で提供されるＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に調製することができる。同様にＡＡＶ９配列および他の血清型のＡＡＶキャプシドを含むさらに他のｒＡＡＶウイルスベクターを調製することもできる。 このように当業者は、本発明のＡＡＶ９配列を、インビトロ、エクスビボまたはインビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系での使用に容易に適合させることができると容易に理解するだろう。同様に当業者は種々のｒＡＡＶおよび非ｒＡＡＶベクター系で使用するために、本発明のＡＡＶ９ゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクター系は、中でも例えばレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含む。これらベクター系の選択は本発明を限定しない。 このように本発明はさらに、本発明の新規ＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を使用して生成したベクターを提供する。そのようなベクターは治療用分子の送達およびワクチン処方における使用を含む様々な目的に有用である。治療用分子の送達に特に望ましいのは、本発明の新規ＡＡＶのキャプシドを含有する組換えＡＡＶである。本発明の新規ＡＡＶ配列を含むこれらまたは他のベクター構築物をワクチン処方に、例えばサイトカインとの同時送達に、または免疫原自体の送達に使用することができる。Ｖ．組換えウイルスおよびその使用 本明細書に記載する技術を使用して、当業者は本発明の血清型８のキャプシドを有するか、またはＡＡＶ９の１以上のフラグメントを含むキャプシドを有するｒＡＡＶを生成することができる。１つの態様では、単一の血清型、例えばＡＡＶ９［配列番号２］に由来する完全長のキャプシドを利用することができる。別の態様では、別の選択したＡＡＶ血清型に由来するか、またはＡＡＶ９のヘテロロガスな部分に由来する配列に枠内で融合したＡＡＶ９の１以上のフラグメントを含む完全長のキャプシドを生成することができる。例えばｒＡＡＶはＡＡＶ９の１以上の新規な超可変領域配列を含むことができる。あるいは本発明の独自なＡＡＶ９配列を、他のウイルスまたは非ウイルス配列を含む構築物に使用することができる。場合により組換えウイルスは１以上のＡＡＶ９ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ９ｒｅｐ配列を持つことができる。Ａ．ウイルスの送達 別の観点では、本発明は導入遺伝子を宿主に送達するための方法を提供し、この方法には選択した宿主細胞を本発明のＡＡＶ９配列（またはその機能的フラグメント）を用いて生成した組換えウイルスベクターでトランスフェクトまたは感染させることが含まれる。送達法は当業者には周知であり、そして本発明を限定しない。 １つの望ましい態様では、本発明はＡＡＶ９が媒介する導入遺伝子の宿主への送達法を提供する。この方法には選択した導入遺伝子およびＡＡＶ９キャプシドタンパク質の発現を支配する配列の制御下に選択した導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターで、選択した宿主細胞をトランスフェクトまたは感染させることが含まれる。 場合により選択したＡＡＶ血清型に対する抗体の存在について、宿主からのサンプルを最初にアッセイすることができる。中和抗体を検出するための様々なアッセイ形式が当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は本発明を限定しない。例えばＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（１９９７年３月）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９；４７７−４８５（１９９８年３月１日）。このアッセイの結果を使用して、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不存在により、特定の血清型のキャプシドタンパク質を含むどのＡＡＶベクターが送達に好適であるかを決定することができる。 この方法の１つの観点では、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を持つベクターの送達が、異なる血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を持つベクターを介する遺伝子の送達の前もしくは後に行われる。すなわちｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達を、選択した宿主細胞に反復して遺伝子を送達するために使用することができる。望ましくは続いて投与するｒＡＡＶベクターは最初のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を運ぶが、続いて投与されるベクターは最初のベクターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含む。例えばもし最初のベクターがＡＡＶ９キャプシドタンパク質を有するならば、続いて投与されるベクターは限定するわけではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８を含む他の血清型の中から選択されるキャプシドタンパク質を有することができる。 上記の組換えベクターは公開された方法に従い宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合性のある担体中に懸濁されたｒＡＡＶを、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与することができる。適当な担体は転移するウイルスが向けられる兆候の観点から当業者により容易に選択され得る。例えば１つの適当な担体には種々の緩衝化溶液を用いて配合される塩水（例えばリン酸緩衝化生理食塩水）を含む。他の例示担体には滅菌塩水、ラクトース、シュクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水を含む。担体の選択は本発明を限定しない。 場合により本発明の組成物はｒＡＡＶおよび担体（１つまたは複数）に加えて、保存剤または化学的安定化剤のような他の通例の製薬学的成分を含むことができる。適当な例示的保存剤にはクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。適当な化学的安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンを含む。 ウイルスベクターは細胞をトランスフェクトし、そして医学的分野における当業者により決定され得る不適当な副作用を与えずに、または医学的に許容され得る生理学的効果で治療的利益を提供するために十分なレベルの遺伝子転移および発現を提供するために十分な量で投与される。通例の、そして製薬学的に許容され得る投与経路には限定するわけではないが、肝臓または肺へ直接的に、経口的に、鼻内に、気管内に、吸入により、静脈内に、筋肉内に、眼内に、皮下に、皮内に送達するか、または他の非経口投与経路を含む。投与経路は所望により組み合わせることができる。 ウイルスベクターの投薬用量は、処置する状態、患者の年齢、体重および健康のような因子に主に依存し、そして患者間で変動し得る。例えばウイルスベクターの治療に有効なヒトへの投薬用量は、一般に約１×１０９〜約１×１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む約１ｍｌ〜約１００ｍｌ溶液の範囲内である。好適なヒトへの投薬用量は約１×１０１３〜１×１０１６ＡＡＶゲノムとなり得る。投薬用量は副作用に対して治療的利益のバランスを取るように調整され、そしてそのような投薬用量は組換えベクターを使用する治療的応用に依存して変動することができる。導入遺伝子の発現レベルは投薬頻度を決定するために監視することができ、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含むＡＡＶベクターをもたらす。場合により治療目的に記載されたものに類似する投薬計画を、本発明の組成物を使用して免疫感作するために利用することができる。 本発明のＡＡＶ９を含むベクターにより送達するための治療用産物および免疫原性産物の例を以下に提供する。これらのベクターは本明細書に記載するように、種々の治療用またはワクチン接種計画に使用することができる。さらにこれらのベクターは１以上の他のベクターまたは有効成分と組み合わせて、望ましい治療用かつ／またはワクチン接種計画で送達され得る。Ｂ．治療用の導入遺伝子 導入遺伝子によりコードされる有用な治療用産物には、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを含むトランスフォーミング増殖因子αスーパーファミリーの任意のもの、あるいは任意の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のＢＭＰｓ１〜１５、増殖因子のヒレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ 分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの任意のもの、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、アグリン、セマフォリン／コラポスリンファミリーの任意のもの、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン類（ｅｐｈｒｉｎｓ）、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび増殖および分化因子を含む。 他の有用な導入遺伝子産物には、限定するわけではないがトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ１８の含む）、単球誘引タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫系により生産される遺伝子産物も、本発明に有用である。これらには限定するわけではないが免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、単鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を含む。有用な遺伝子産物には補体調節タンパク質、膜コファクタータンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質を含む。 さらに他の有用な遺伝子産物には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レセプター、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプターおよびスカベンジャーレセプターを含むコレステロール調節に関するレセプターを包含する。また本発明は、グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプター、ビタミンＤレセプターおよび他の核レセプターを含むステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーの員のような遺伝子産物も包含する。加えて有用な遺伝子産物には、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ−結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、および翼型ヘリックス（ｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ）タンパク質のフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）ファミリーのような転写因子を含む。 他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ、デヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グリコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列を含む。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素の欠損活性から生じる様々な状態に有用な酵素代替療法に有用となり得るような酵素を含む。例えばマンノース−６−ホスフェートを含む酵素は、リソソーム蓄積症（例えば適当な遺伝子にはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを含む）の治療に利用することができる。 他の有用な遺伝子産物には、挿入、削除またはアミノ酸置換を含む自然には存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドのような自然には存在しないポリペプチドを含む。例えば単鎖の工作された免疫グロブリンは特定の免疫抑制患者に有用となり得る。他の種類の自然には存在しない遺伝子配列には、標的の過剰発現を低下させるために使用することができるアンチセンス分子およびリボザイムのような触媒核酸を含む。 遺伝子発現の減少および／または調節は、癌および乾癬のような過増殖細胞の特徴である過増殖状態を処置するために特に望ましい。標的とするポリペプチドには、正常細胞に比べて過増殖細胞で排他的に、または高レベルで生産されるポリペプチドを含む。標的抗原には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎおよびトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦのような癌遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。標的抗原として癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療および防御的処方のための標的ポリペプチドには、Ｂ細胞リンパ腫により作られた抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの可変領域を含み、これらは態様によっては自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞中で高レべルで見いだされるポリペプチドのような標的ポリペプチドとして使用することができる。 他の適切な治療用ポリペプチドおよびタンパク質には、細胞レセプターおよび“自己”に向かう抗体を生産する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対して広範な防御免疫応答を与えることによる自己免疫疾患および障害を患っている個体を処置するために有用となり得るものを含む。Ｔ細胞性自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む。これらの各疾患は、内因性の抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関係する炎症カスケードを開始するＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）を特徴とする。Ｃ．免疫原性導入遺伝子 あるいはまたは加えて、本発明のベクターは本発明のＡＡＶ９配列および選択した免疫原に対して免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子を含むことができる。例えば免疫原は種々のウイルス科から選択することができる。免疫応答が望まれる望ましいウイルス科の例は、一般的な風邪の原因の約５０％を占めるライノウイルス属；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのようなヒト腸内ウイルスを含む腸内ウイルス属；および主に非−ヒト動物において足および口の疾患の原因であるアフトウイルス属を含むピコルナウイルス科を含む。ピコルナウイルス科内のウイルスで、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを含む。別のウイルス科には、流行性胃腸炎の重要な病原体であるウイルスのノーウォーク群を包含するカルシウイルス科を含む。ヒトおよび非−ヒト動物に免疫応答を誘導するための標的抗原として使用するために望ましいさらに別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロス川ウイルスおよびベネゼエラ、東部および西部ウマ脳髄膜炎を含むアルファウイルス属、および風疹ウイルスを含むルビウイルスを含むトガウイルス科である。フラビウイルス科にはデング、黄熱、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスを含む。他の標的抗原は、感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数の非−ヒトウイルス、および普通の風邪および／または非−Ａ、ＢまたはＣ型肝炎の原因となり得るヒト呼吸コロナウイルスを含むＣ型肝炎またはコロナウイルス科から生成することができる。コロナウイルス科内で、標的抗原にはＥ１（Ｍまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥまたは赤血球凝集素−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）、糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在するわけではない）、またはＮ（ヌクレオキャプシド）を含む。さらに別の抗原は、ベシキュロウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的な狂犬病ウイルス（例えば狂犬病）を含むラブドウイルス科を標的とすることができる。ラブドウイルス科内で適当な抗原は、Ｇタンパク質またはＮタンパク質に由来することができる。マールブルグおよびエボラウイルスのような出血性の発熱ウイルスを含むフィロウイルス科も抗原の適当な供給源となり得る。パラミクソウイルス科には、１型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ウシ３型パラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、２型パラインフルエンザウイルス、４型パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンバーを含むモルビリウイルス、および呼吸合胞体ウイルスを含むニューモウイルスを含む。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルスの科に分類され、そして抗原の適切な供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラ クロス（Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ））、フレボウイルス属（リフト渓谷熱）、ハンタウイルス属（プレマーラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビヒツジ病）および種々の割り当てられていないブニガウイルス属（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）を含む。アレナウイルス科は、ＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属（これは小児の急性胃腸炎の原因である）、オルビウイルス属およびカルチウイルス属（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）を含む。レトロウイルス科には、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（これはＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプーマウイルスを含む）のようなヒトおよび獣医学上の疾患を包含するオンコリウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）の亜科を含む。パポバウイルス科にはポリオーマウイルス（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）の亜科およびパピローマウイルス（癌または乳頭腫の悪性の進行に関連する）の亜科を含む。アデノウイルス科には呼吸疾患および／または腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科のネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコパンロイコペニアウイルス（ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａｖｉｒｕｓ）、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科には、シンプレックスウイルス属（ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセーロウイルス属（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス属（ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））を含むベータヘルペスウイルス亜科、およびリンホクリプトウイルス属（ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、伝染性鼻気管支炎、マルク病ウイルスおよびラジノウイルス属（ｒｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含むガンマヘルペスウイルス亜科を含む。ポックスウイルス科にはオルソポックスウイルス（バリオーラ（Ｖａｒｉｏｌａ）（痘瘡）およびワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含する脊椎動物ポックスウイルス亜科、およびエントモポックスウイルスの亜科を含む。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスを含む。適当な抗原源となり得る１つの分類されていないウイルスは、デルタ肝炎ウイルスである。さらに抗原の供給源である別のウイルスはニパ（Ｎｉｐａｎ）ウイルスである。さらに別のウイルス源には、鳥類感染性嚢疾患ウイルスおよびブタ呼吸および生殖症候群ウイルスを含む。アルファウルイス科にはウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。 本発明はヒトまたは非ヒト動物を、ヒトおよび非ヒト動物に感染する細菌、菌類、寄生微生物もしくは多細胞寄生生物を含む他の病原体に対して免疫感作するために有用な免疫原、あるいは癌細胞または腫瘍細胞に由来する免疫原も包含する。細菌病原体の例には、病原性グラム陽性球菌を含み、それらには肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）；ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（およびそれらにより生産されるトキシン、例えばエンテロトキシンＢ）；および連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を含む。病原性グラム陰性球菌には髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）；淋菌（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびイケネーラ属（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ属（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲーラ属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィラス属（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセーラ属（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；Ｈ．デュクレイ（ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ種（ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）；野兎病菌（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；ペスト菌（ペスト）および他のエルシニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ属）；ストレプトバシラス モニリホルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリウム属（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）を含む；グラム陽性桿菌にはリステアリモノシトゲネシス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径肉芽腫）；およびバルトネラ症を含む。病原性の嫌気性細菌により引き起こされる疾患には、破傷風；ボツリヌス中毒（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびそのトキシン）；ガス壊疽菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのイプシロン トキシン；他のクロストリジウム属（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；結核；ハンセン病；および他のマイコバクテリア属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含む。病原性スピロヘーター疾患には梅毒；トリポネーマ症；フランベジア、ピンタおよび性行為外の梅毒；およびレプトスピラ症を含む。より高等な病原性細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染には、馬鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）；放線菌症；ノルカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイドミコーシス症、ペトリリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコシース；および皮膚糸状菌症を含む。リケッチア感染にはチフス熱、ロッキー山熱病、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）：およびリケッチア痘を含む。マイコプラズマおよびクラミジア感染の例には：マイコプラズマ肺炎；リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染を含む。病原性真核生物には、病原性原生成物および蠕虫を含み、そしてそれらにより引き起こされる感染には；アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラズマ ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住虫吸虫症；線虫；吸虫綱に属する吸虫類または吸虫類；および多節条虫亜綱（条虫）感染を含む。 多くのこれら生物および／またはそれらにより生産されたトキシンが疾病管理センター［（ＣＤＣ）、米国の保健福祉省］により、生物学的攻撃に使用するための可能性を有する病原体として同定された。例えばこれら生物剤の幾つかには、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（悪疫）、大痘瘡（痘瘡）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、およびウイルス性出血熱［フィロウイルス属（例えばエボラ、マールブルグ］、およびアレナウイルス属［例えばラッサ、マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ］）これらすべては現在、カテゴリーＡ剤に属する；Ｑ熱リケッチア菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（ブルセラ症）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシン トキシン）、ガス壊疽（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（イプシロントキシン）、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびそのトキシン（エンテロトキシンＢ）、クラミジア シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に関する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム パルバム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、チフス熱（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ ｐｏｗａｚｅｋｉｉ））およびウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネゼエラ ウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；このすべてが現在、カテゴリーＢ剤に属する；および現在、カテゴリーＣ剤に分類されるニパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスおよびハンタウイルスを含む。さらにそのように分類されるか、または異なって分類される他の生物を、将来、そのような目的に同定し、かつ／または使用することができる。本明細書に記載するウイルスベクターおよび他の構築物はこれらの生物、ウイルス、それらのトキシンまたは副産物に由来する抗原を送達するために有用であり、これによりこれらの生物剤で感染または他の副作用が防止され、かつ／または処置されると考えられる。 Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、ＣＴＬｓを含む免疫応答を誘導してこれらＴ細胞を排除する。慢性関節リウマチ（ＲＡ）では、疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）の幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲｓにはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶ−１７を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。多発性硬化症（ＭＳ）では、疾患に関与するＴＣＲｓの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲｓにはＶ−７およびＶ−１０を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。硬皮症では、この疾患に関与するＴＣＲｓの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのＴＣＲｓにはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶ−１６、Ｖ−３Ｃ、Ｖ−７、Ｖ−１４、Ｖ−１５、Ｖ−１６、Ｖ−２８およびＶ−１２を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸分子の送達は、硬皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘導する。 このように本発明のｒＡＡＶ９に由来する組換えウイルスベクターは、選択した導入遺伝子を、生物が１以上のＡＡＶ血清型の中和抗体を有する選択した宿主細胞にインビボまたはエクスビボで送達することができる効率的な遺伝子転移媒体を提供する。１つの態様では、ｒＡＡＶおよび細胞はエクスビボで混合され；感染した細胞は常法を使用して培養され；そして形質導入された細胞が患者に再注入される。 本発明のベクターは治療目的および防御免疫を誘導することを含む免疫感作のための遺伝子送達に特によく適している。さらに本発明のベクターはインビトロで所望する遺伝子産物の生産にも使用することができる。インビトロ生産については、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含むｒＡＡＶで宿主細胞をトランスフェクトし、そして発現を可能とする条件下で細胞のカルチャーを培養した後に所望のカルチャーから得ることができる。次いで発現した産物を所望により精製し、そして単離する。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離に関する適当な技法は、当業者には知られている。 以下の実施例は本発明の幾つかの観点および態様を具体的に説明する。 ＡＡＶ２ ＩＴＲｓを備えた組換えＡＡＶ９ウイルスゲノムの生産 ＡＡＶ２ｒｅｐを新規ＡＡＶ血清型のｃａｐ配列と融合することによりキメラパッケージング構築物を作成する。これらキメラパッケージング構築物は、最初にＡｄ５ヘルパープラスミドを使用して２９３細胞での３回のトランスフェクションにより、ＡＡＶ２ ＩＴＲｓを持つ組換えＡＡＶゲノムのシュードタイプ化に使用する。これらのシュードタイプ化ベクターはこれら新規血清型の完全かつ感染性ウイルスが単離される前に、形質導入に基づく血清型の実験における性能を評価し、そしてＮＨＰおよび齧歯類を含む種々の動物モデルを対象として新規ＡＡＶ血清型の遺伝子転移効率を評価するために使用する。Ａ．ｐＡＡＶ２ＧＦＰ ＡＡＶ２プラスミドは、構成的プロモーターの制御下で発現するＡＡＶ２ ＩＴＲｓおよび緑色蛍光タンパク質を含む。このプラスミドは以下の要素を含む：ＡＡＶ２ＩＴＲｓ、ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰコード配列。Ｂ．トランスプラスミドのクローニング 組換えシュードタイプ化ＡＡＶ９ベクター生産用のキメラトランス−プラスミドを構築するために、ｐ５Ｅ１８プラスミド（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４−４００３）をＸｈｏＩで部分消化して、プラスミドを３１６９ｂｐのみの位置のＸｈｏＩ部位で線状とした。次いでＸｈｏＩ切断末端をフィルインし、そして戻し連結した。この修飾されたｐ５Ｅ１８プラスミドをＸｂａＩおよびＸｈｏＩで完全に消化するまで制限処理してＡＡＶ２ｃａｐ遺伝子配列を除去し、そしてｐＣＲＡＡＶ９６−５＋１５−４プラスミドから単離したＡＡＶ９ｃａｐ遺伝子を含む２２６７ｂｐのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントに置き換えた。 生成したプラスミドはＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターの制御下にＲｅｐ７８／６８のＡＡＶ２ｒｅｐ配列を、そしてＡＡＶ２ Ｐ１９プロモーターの制御下にＲｅｐ５２／４０のＡＡＶ２ ｒｅｐ配列を含む。ＡＡＶ９キャプシド配列はＡＡＶ２ Ｐ４０プロモーターの制御下にあり、これはＲｅｐ配列内に位置する。このプラスミドはさらにｒｅｐ ＯＲＦのスペーサー５’を含む。 あるいはＡＡＶ９ｒｅｐ配列および天然のＡＡＶ９プロモーター配列を利用する類似のプラスミドを構築することができる。次いでこのプラスミドは本明細書に記載するようにｒＡＡＶ９の生産に使用する。Ｃ．シュードタイプ化ｒＡＡＶの生産 ｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ９キャプシド中のＡＡＶ２ベクター）は、アデノウイルスを含まない方法を使用して生成する。簡単に説明すると、シスプラスミド（ＡＡＶ２ ＩＴＲｓを含むｐＡＡＶ２．１ ｌａｃＺプラスミド）、およびトランスプラスミドｐＣＲＡＡＶ９６−５＋１５−４（ＡＡＶ２ｒｅｐおよびＡＡＶ８ｃａｐを含む）およびヘルパープラスミドをそれぞれ同時に２９３細胞に１：１：２の比率でリン酸カルシウム沈殿によりコトランスフェクトした。 ｐＡｄヘルパープラスミドの構築については、ｐＢＧ１０プラスミドをマイクロビックス（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）（カナダ）から購入した。Ｌ２およびＬ３を含むＲｓｒＩＩフラグメントをｐＢＨＧ１０から削除し、第１ヘルパープラスミドであるｐＡｄＦ１３を生じた。プラスミドＡｄＦ１は、ｐＢＨＧ１０から単離したＰｍｅＩ／Ｓｇｆｌ削除を含むＡｓｐ７００／ＳａｌＩフラグメントを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングすることにより構築した。ＭＬＰ、Ｌ２、Ｌ２およびＬ３をｐＡｄＦ１中で削除した。さらに２．３ｋｂのＮｒｕＩフラグメント、そして続いて０．５ｋｂのＲｓｒＩＩ／ＮｒｕＩフラグメントの削除によりそれぞれヘルパープラスミドｐＡｄＦ５およびｐＡｄＦ６を生成した。ｐＦ６と名付けられたヘルパープラスミドは、Ｅ１−発現ヘルパー細胞によっては提供されないＥ２ａおよびＥ４ ＯＲＦ６の本質的ヘルパー機能を提供するが、アデノウイルスキャプシドタンパク質および機能的Ｅ１領域が削除されている。 典型的には５０μｇのＤＮＡ（シス：トランス：ヘルパー）を、１５０ｍｍの組織培養皿上にトランスフェクトした。２９３細胞をトランスフェクションから７２時間後に回収し、超音波処理し、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理した（３７Ｃで１０分）。細胞ライゼートを２回のＣｓＣｌ勾配に供した。ｒＡＡＶベクターを含むピーク画分を集め、プールし、そしてＰＢＳに対して透析した。家族性高コレステロール血症のマウスモデル 以下の実施例では、本明細書に記載したように構築したＡＡＶ２／９ｒＡＡＶが家族性高コレステロール血症のマウスモデルにおいてＬＤＬレセプターを送達し、そして血漿コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを減少させるために十分な量でＬＤＬレセプターを発現することを示す。 以下の実験で使用したｒＡＡＶ２／９構築物は、β−アクチンプロモーターから駆動され、そしてサイトメガロウイルスエンハンサーから強化されるマウスＬＤＬレセプター（ＬＤＬＲ）用のｃＤＮＡを含む（ＡＡＶ−ＣＢ−ＶＬＤＬＲ）。家族性の高コレステロール血症の症状を現す高コレステロール食事でのＬＤＬ−欠損マウス（ジャクソンラボラトリーズ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、（ＦＨマウス）に４×１０１２ＡＡＶ−ＣＢ−ＬＤＬＲまたは塩水対照を静脈内注入し、そして血漿コレステロールレベルをモニタリングした。 ＶＬＤＬＲウイルスを注入したＦＨマウスの血漿コレステロールおよびトリグリセリドのプロフィールは以下のように決定する。上記のように処置したマウスを６時間絶食させ、そして血液サンプルをヘパリン処理した毛細管を用いて後眼窩静脈叢穿刺により集める。血漿を遠心により分離する。総コレステロールおよびトリグリセリドの濃度は、ワコーケミカルズ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入したキットを使用して決定する。 対照群のマウスは注射から約４週間後に定常状態になるまでコレステロールレベルが次第に上昇した。ＬＤＬＲウイルスを受容したマウスは、確実な血漿コレステロールレベルの減少がウイルス投与から３週間後に始まる。 ＬＤＬＲウイルスを注入したＦＨマウスに由来する血漿のコレステロールプロフィールは、ＦＰＬＣ分析により得る。マウスの血漿を各群４匹のマウスからプールする。血漿サンプルは対照およびＡＡＶ−ＶＬＤＬＲ注入動物から注射前（ＰＩ）またはウイルス注入から２カ月後（２Ｍ）に分離し、そしてＦＰＬＣ分画、続いてコレステロールアッセイにより分析する。ＡＡＶ９血清型ベクターのインビボ形質導入 新規ＡＡＶ９血清型に基づくベクターの性能を、筋肉および肝臓に向けられたマウスモデルで評価し、そして既知の血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５に基づくベクターと比較する。分泌型タンパク質を発現するベクターを使用して血清のＥＬＩＳＡ分析を介して種々の血清型間の相対的形質導入効率を定量する。標的組織内の形質導入の細胞分布は、ｌａｃＺ発現ベクターおよびＸ−ｇａｌ組織化学を使用して評価する。 この実験には組換えＡＡＶゲノムであるＡＡＶ２ＣＢｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＡｌｂｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＣＭＶｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｃＦＩＸ、ＡＡＶ２ＣＭＶＬａｃＺおよびＡＡＶ２ＴＢＧＬａｃＺを、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５キャプシドタンパク質でパッケージングする。すべての構築物において、ミニ遺伝子カセットをＡＡＶ２ ＩＴＲｓで挟む。ヒトα−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）［Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，３９９４−４００３］、アカゲザルのコリオゴナドトロピンホルモン（ＣＧ）のβ−サブユニット［Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ２，６５７−９］、イヌ第ＩＸ因子［Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１１５６３−６］、および細菌のβ−ガラクトシダーゼ（すなわちＬａｃＺ）遺伝子のｃＤＮＡをレポーター遺伝子として使用する。肝臓に向けた遺伝子転移には、マウスのアルブミン遺伝子プロモーター（Ａｌｂ）［Ｘｉａｏ，Ｗ．（１９９９）、同上］またはヒトの甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）［Ｗａｎｇ，（１９９７）同上］のいずれかを使用して肝臓に特異的なレポーター遺伝子の発現を駆動する。筋肉に向けられた遺伝子転移実験では、サイトメガロウイルス初期プロモーター（ＣＭＶ）またはＣＭＶエンハンサー（ＣＢ）を持つニワトリβ−アクチンプロモーターをレポーターの発現を支配するために採用する。 筋肉に向けられた遺伝子転移には、ベクターを４〜６週齢のＮＣＲヌードまたはＣ５７ＢＬ／６マウス（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）の右脛側前方に注射する。肝臓に向けられた遺伝子転移実験では、ベクターを７〜９週齢のＮＣＲヌードまたはＣ５７ＢＬ／６マウス（タコニック、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）の門脈内に注入する。血清サンプルはベクター投与から異なる時点で眼窩内から集める。筋肉および肝臓組織は、低温切開およびＸｇａｌ組織化学染色用にｌａｃＺベクターを受容した動物から異なる時点で回収する。再投与実験については、Ｃ５６ＢＬ／６マウスは最初にＡＡＶ２／１、２／２、２／５および２／９ＣＢＡ１ＡＴベクターを筋肉内に受け、そしてＡ１ＡＴ遺伝子発現を７週間追跡する。以前の実験では、免疫コンピテントなＣ５７ＢＬ／６マウスがＡＡＶベクターから発現した時、ヒトＡ１ＡＴタンパク質に対して限られた液性応答を誘導することが示された［Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，３９９４−４００３］。次いで動物はＡＡＶ２／９ＴＢＧｃＦＩＸを用いて門脈内で処置され、そしてｃＦＩＸ遺伝子発現について実験した。 ｈＡ１ＡＴ、ｒｈＣＧおよびｃＦＩＸタンパク質の血清レベルを定量するために、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイをすでに記載したように［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，８９３４−４３；Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２，６５７−９；Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１１５６３−６］、行った。この実験は、ＤＮＡ抽出およびベクター調製［Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３．６９７−７０７］の滴定と同じ組のプライマーおよびプローブを使用して、ＴａｑＭａｎによる標的組織中に存在するベクターのゲノムコピーの定量的分析のために、筋肉および肝臓組織を回収するために動物が屠殺された時に完了した。 本明細書に引用したすべての刊行物は、参考により本明細書に編入する。本発明は特に好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができると考える。そのような修飾は本発明の範囲内である。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ＡＡＶ９のｒｅｐおよびｃａｐ領域の核酸配列である［配列番号１］。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、公開された配列のＡＡＶ２［配列番号４］、ＡＡＶ１［配列番号５］およびＡＡＶ３［配列番号６］、および同時係属出願の主題である新規血清型ＡＡＶ８［配列番号７］と比較した本発明の新規ＡＡＶ９［配列番号２］配列のキャプシドのｖｐ１タンパク質のアミノ酸配列のアライメントである。このアライメントはＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して行い、ＡＡＶ２の番号を参照に使用した。ＡＡＶ９配列の下線および太字は、ＨＶＲ内のカセットの同一性を示す。図３Ａ、３Ｂおよび３ＣはＡＡＶ９ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列である［配列番号３］。配列表 配列番号２のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含んでなるＡＡＶ９キャプシドタンパク質、及び、ＡＡＶ逆方向末端反復並びに宿主細胞で発現を支配する調節配列に操作可能に連結されたヘテロロガスな遺伝子、を含んでなるミニ遺伝子、を含んでなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。 ＡＡＶキャプシドが、（ａ）ａ） ｖｐ１キャプシドタンパク質、アミノ酸（ａａ）１〜７３６；および、 ｂ） ｖｐ２キャプシドタンパク質、ａａ１３８〜７３６、からなる群から選択されるＡＡＶキャプシドタンパク質の配列を含んでなる、請求項１に記載するＡＡＶであって、 ここでアミノ酸番号は配列番号２の番号である上記ＡＡＶ。 請求項１または２に記載のＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列を含んでなる分子。 上記核酸配列が： ｖｐ１、ｎｔ２１２１〜４３２３； ｖｐ２、ｎｔ２５３２〜４３２３；および ｖｐ３、ｎｔ２７３０〜４３２３、ここでヌクレオチド番号は配列番号１の番号である、からなる群から選択される請求項３に記載の分子。 上記分子がＡＡＶキャプシドタンパク質および機能的ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ配列を含んでなる、請求項３または４に記載の分子。 上記分子がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６からなる群から選択される血清型に由来するｃａｐタンパク質または機能的ＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含んでなる請求項５に記載の分子。 上記分子がプラスミドである請求項３ないし６のいずれかに記載の分子。 ＡＡＶ血清型キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成する方法であって：（ａ）ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする分子；（ｂ）機能的ｒｅｐ遺伝子；（ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）および導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子；および（ｄ）ミニ遺伝子のＡＡＶキャプシドタンパク質へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能、を含む宿主細胞を培養する工程を含んでなり、該宿主細胞が請求項３ないし７のいずれかに記載の分子を含んでなる上記方法。 請求項１または２に記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項３ないし７のいずれかに記載の分子でトランスフェクトした宿主細胞。